中国学术期刊网 » 论文 » 理学论文 » 理学专业论文 » 一氧化氮和天然抗氧化剂的组合产品对心力衰竭的防治作用论文正文

一氧化氮和天然抗氧化剂的组合产品对心力衰竭的防治作用

中国学术期刊网【理学专业论文】 编辑:天问 中国科学院大学学报 2016-11-05一氧化氮和天然抗氧化剂的组合产品对心力衰竭的防治作用论文作者:冯润 王红云 赵保路 陆忠兵,原文发表在《中国科学院大学学报杂志》,经中国学术期刊网小编精心整理,仅供您参考。

关键词: 心力衰竭 一氧化氮 天然抗氧化剂 心肌肥厚
摘要: 研究一种以一氧化氮合酶底物L-精氨酸和山楂提取物、虾青素和知母宁等天然抗氧化剂为主要成分的配方产品ZPF1对心肌的保护作用.发现,ZPF1显著促进大鼠心肌细胞H9C2细胞增殖,减少苯肾上腺素诱导的活性氧.在异丙肾上腺素(ISO)诱导小鼠心肌肥厚的模型中,喂食100 mg/(kg·d)的ZPF1显著抑制ISO引起的心肌肥厚和功能失常,其机制与上调SERCA2a蛋白有关.这些事实说明,一氧化氮和天然抗氧化剂的组合产品ZPF1对心力衰竭有较好的防治作用.

随着全球人口老龄化的趋势日益明显和饮食结构的变化,心血管疾病发病率和死亡率呈逐年上升的趋势,已经发展成为威胁生命健康的头号杀手.心肌肥厚,尤其是左心室肥厚是高血压、心瓣膜病、心肌梗死等许多心血管疾病共同的病理过程.持续的心肌肥厚伴随着心肌纤维化增加、心肌细胞凋亡增加、钙离子浓度失衡,最终可导致心力衰竭等多种疾病.因此,预防和治疗心肌肥厚具有十分重要的理论价值和实际意义.

一氧化氮(NO)是体内的一种信号分子,由细胞内L-精氨酸(L-Arg)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)作用下产生.NO具有舒张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖和血小板聚集等作用,在调节血压和血管稳态方面发挥重要的生理作用[1].L-Arg不足、内源性NOS抑制剂产生增多、NOS酶的辅助因子缺乏和氧化应激都会直接或间接地造成NO的生物利用度的下降,引起血管内皮功能失常,进而引发多种心血管疾病[2].另一方面,在一些病理条件(如心肌缺血再灌注、动脉粥样硬化等)下,NO可以和超氧阴离子(O2·-)反应生成氧化性更强的过氧亚硝基(ONOO-),进而导致蛋白质、核酸及脂质膜发生氧化损伤,引起细胞凋亡[3-4].因此,NO在心血管疾病中发挥着“双刃剑”的作用.

已有研究表明,天然抗氧化剂可以清除缺血再灌注损伤时产生的氧自由基,调节和促进NO自由基产生,保护心肌组织,防止缺血再灌注损伤[4-8].因此我们推测,将天然抗氧化剂和NOS的底物L-Arg进行合理配比,可以达到减少氧化应激,提高NOS酶的活性和NO的生物利用度,保护心血管系统的效果.经过大量试验,我们研制了一种以山楂提取物、知母提取物、虾青素和L-Arg为主要成分的配方ZPF1,发现它能够在多个模型中减少氧化应激,增加NO水平[9],但其是否具有心血管保护作用还不清楚.因此,本文在细胞和动物模型中研究这种NO和天然抗氧化剂组合配方ZPF1对心肌肥厚的保护作用.

1 材料和方法

1.1 实验材料
大鼠心肌细胞H9C2购自北京协和细胞资源中心,SPF级8~10周龄雄性C57BL6小鼠购自北京维通利华公司.L-Arg、硝普钠(SNP)、苯肾上腺素(PE)、异丙肾上腺素(ISO)、MTT和DCFH-DA荧光探针购自Sigma公司.SERCA2a和GADPH抗体购自Abcam公司.蛋白酶抑制剂混合物购自Roche公司.山楂提取物、知母提取物和虾青素购自西安清乐生物科技有限公司.将这些天然抗氧化剂和L-Arg按照一定比例混合组成ZPF1,溶于超纯水中,以灌胃的方式喂食动物.其他试剂为国产分析纯,购自北京国药集团.

1.2 实验方法
1.2.1 细胞活力测定
取对数生长期的H9C2细胞,以1×104个/孔的密度接种于96孔平底培养板上,在37 ℃,5%CO2中培养24 h,再使用不同浓度的L-Arg、SNP和ZPF1处理24 h,然后每孔加入MTT(终质量浓度为0.5 g/L),继续培养3 h,弃去培养液,每孔加入200 μL DMSO,振荡1.5 min,在酶标板上测定吸光度值(OD值),测定波长492 nm.每组设8个平行孔,空白对照组不接种细胞.细胞活力按下列公式计算:细胞活力(%)=(实验组各孔OD值-空白对照OD值)/(正常对照组OD值-空白对照OD值),对照组细胞活力为100%.

1.2.2 细胞内活性氧水平的检测
以5×104个/孔的密度接种于24孔平底培养板上,继续培养24 h,再用50 μmol/L PE或其他药物处理48 h.更换新鲜培养基,并将DCFH-DA探针(终浓度5 μmol/L)加入孔中,继续在培养箱中孵育30 min后,PBS清洗3遍.用0.4 mol/L NaOH溶液裂解细胞,将细胞裂解液取200 μL加入到96孔黑色微孔板中,使用多功能酶标仪测定DCF荧光强度,同时采用BCA法测定蛋白浓度,用二者的比值表示相对密度蛋白的荧光值.每组设4个平行孔.

1.2.3 动物实验
将体重和年龄无明显区别的C57BL/6雄性小鼠随机分为3组,每组5~6只小鼠.对照组每天腹腔注射生理盐水,模型组按照每天20 mg/kg的剂量腹腔注射ISO,连续注射14 d,给药组除每天注射同样剂量的ISO外,同时每天给予ZPF1,剂量为100 mg/kg.实验完成后,利用首都医科大学Vevo 2100超高分辨率小动物超声影像系统对小鼠进行超声检测,数值取3个心动周期的平均值.所有动物处死前称量体重,断颈处死后迅速取出心脏和肺脏,称重.心脏组织在液氮里速冻后存放于-80 ℃冰箱,用于后续分析.

1.2.4 Western blot检测
对照或药物处理后的细胞样品或心肌组织样品用预冷的RIPA缓冲液(含蛋白酶抑制剂)裂解或高速匀浆处理后,12 000 g离心15 min,收集上清液用于蛋白表达检测.在使用BCA法测定蛋白质浓度后,将相同量的蛋白与电泳缓冲液混合,沸水浴5 min.按常规方法上样、电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭,按照1∶1 000的比例加入一抗,4 ℃过夜.TBS-T缓冲液清洗后,加入HRP标记的二抗,室温孵育1 h,在TBS-T缓冲液清洗后曝光显影.

1.3 数据统计
实验数据以平均值±标准误值(mean±SE)表示,2组和多组之间的差异采用SPSS 17.0软件包进行单因素方差分析(one way ANOVA),使用Tukey Post Hoc检验.P<0.05被认为具有统计学意义.

2 结果

2.1 NO及ZPF1对细胞活力的影响
为研究NO对心肌细胞活力的影响,我们使用不同浓度的NO供体SNP和L-Arg处理H9C2心肌细胞24 h.SNP在溶液中迅速产生高浓度NO,可能会O2·-结合诱导细胞凋亡.我们发现,SNP对H9C2细胞活性有明显的抑制作用,尤其在较高浓度(图 1(a)).作为NOS的底物,L-Arg能够以温和的速度持续产生低浓度NO,保护细胞.在低浓度时,L-Arg对细胞活力没有明显影响,而在100 μmol/L时可显著提高细胞活力(图 1(a)).我们也研究了ZPF1对细胞活力的影响,发现在150和200 μg/mL的浓度时,ZPF1处理24 h能够提高50%~250%的细胞活力 (图 1(b)).

Fig. 1
Download:
JPGlarger image

H9C2细胞经过不同浓度的药物处理24 h后,MTT法测SNP和L-Arg(a)以及配方药ZPF1(b)对细胞的活力的影响.*P<0.05 vs对照.
图 1 一氧化氮和配方药ZPF1对H9C2心肌细胞活力的影响

Fig. 1 Effect of NO and ZPF1 formula on viability in H9C2 cardiomyocytes
2.2 NO及ZPF1对细胞活性氧的影响
为进一步探讨NO和ZPF1在心肌细胞中的保护作用,我们检测了对照和PE处理细胞中的活性氧水平.和对照细胞相比,5 μmol/L SNP、100 μmol/L L-Arg和200 μg/mL ZPF1单独处理48 h对细胞内活性氧水平没有明显影响.50 μmol/L PE处理48 h后细胞内活性氧增加~40%,ZPF1(200 μg/mL)同时处理48 h可以显著降低细胞活性氧水平,而SNP和L-Arg对PE诱导的细胞活性氧增加没有明显影响(图 2),说明ZPE1减少PE诱导的活性氧主要是通过它的抗氧化剂成分而不是L-Arg.

Fig. 2
Download:
JPGlarger image

H9C2细胞经过ZPF1、SNP、L-Arg单独处理或分别和PE共同处理48 h后,用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧水平.*P<0.05 vs.对照组,#P<0.05 vs.PE处理组
图 2 一氧化氮和配方药ZPF1对H9C2细胞内活性氧水平的影响

Fig. 2 Effect of NO and ZPF1 formula on intracellular ROS level in H9C2 cells
2.3 ZPF1对ISO诱导的心肌肥大和功能失常的影响
我们发现,ISO注射组心脏重量和心脏体重质量比(mg/g)均明显高于对照组(图 3(a)、图 3(b)),同时,ISO注射组中的肺脏体重和肺脏体重质量比(mg/g)也明显高于对照组(图 3(c)、图 3(d)).这些结果证实ISO诱导的心肌肥厚模型建立成功.我们发现,给小鼠喂食ZPF1可以显著降低心脏/肺脏重量以及心脏/肺脏体重质量比(图 3(a)、图 3(b)),表明ZPF1可以显著抑制ISO诱导的心肌肥厚.

Fig. 3
Download:
JPGlarger image

C57BL/6小鼠在腹腔注射异丙肾上腺素ISO造模2周后,分别检测心脏重量(a)、心脏体重质量比(b)、肺脏重量(c)、肺脏体重质量比(d).超声心动法测量心脏功能,以心脏射血分数表示(e).*P<0.05 vs.对照组;#P<0.05 vs.异丙肾上腺素ISO组.
图 3 配方药ZPF1对ISO诱导的心肌肥厚和心脏功能的影响

Fig. 3 Effect of ZPF1 formula on ISO induced myocardial hypertrophy and dysfunction
心肌肥厚往往伴随着心脏功能的下降.造模结束后,ISO注射组小鼠的射血分数由对照组的67.5±0.88下降至48.3±0.36,而ISO+ZPF1组小鼠的射血分数为59.4±0.98,显著高于ISO注射组(图 3(e)).这些数据表明,注射ISO可以引起心脏功能失常,而补充ZPF1可以抑制这一过程,提高心脏功能.

2.4 ZPF1对SERCA2a蛋白表达的影响
肌浆网钙泵-2a(Sarcoplasmic reticulum calcium ATPase-2a,SERCA2a)是心肌细胞中参与Ca2+调节的重要蛋白,在心肌细胞钙循环和心肌的收缩/舒张周期中起着关键作用[10].大量研究显示,在人和小鼠的心力衰竭模型中SERCA2a的蛋白表达和活性有明显降低[11].为研究ZPF1的心肌保护作用机制,我们分别在细胞和动物模型中检测了SECA2a的蛋白表达.实验发现,50 μmol/L PE处理48 h引起SERCA2a蛋白表达显著下降(图 4(a)).虽然添加200 μg/mL ZPF1不影响正常细胞的SERCA2a蛋白表达,但可以显著抑制PE对SERCA2a的下调(图 4(a)).同样,ISO注射组小鼠心脏组织中SERCA2a蛋白表达和对照组明显降低,而这种下降可以被ZPF1所抑制.这些结果说明,ZPF1的心脏保护作用与维持SERCA2a的蛋白表达水平有关.

Fig. 4
Download:
JPGlarger image

在H9C2细胞经过ZPF1、PE和PE+ZPF1分别处理48 h或小鼠造模及给药处理完成后,使用 western blot分别检测H9C2细胞(a)和小鼠心脏组织中(b)SERCA2a的蛋白表达水平,GAPDH蛋白作为内参.*P<0.05 vs.对照组,#P<0.05 vs.PE组或ISO组.
图 4 配方药对H9C2心肌细胞和衰竭心脏组织中SERCA2a蛋白表达的影响

Fig. 4 Effect of ZPF1 formula on SERCA2a protein expression in H9C2 and failing hearts
3 讨论

在心血管系统中,内皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化L-Arg产生的NO能够调节血压、扩张血管、抑制血小板聚集和白细胞黏附、抑制血管平滑肌细胞增殖.和野生型小鼠相比,心脏特异性过表达eNOS可以显著改善冠脉结扎引起的心肌肥厚和心室功能下降[12].而给大鼠注射eNOS的抑制剂L-NAME则可以导致高血压和心肌肥厚[13].近年来, 大量研究证实,来自血管内皮的NO产生减少则是加剧心肌肥厚和心力衰竭发生发展的重要因素[14-15].因此,恢复和增强eNOS活性,提高eNOS来源的NO含量,在心衰患者的治疗和预防方面具有重要的研究和临床价值.

心肌肥厚和心力衰竭引起心血管NO含量下降的主要原因包括:首先,心肌肥厚过程中产生了大量的氧自由基,特别是O2·-,可以和NO发生快速反应生成ONOO-[3, 16].其次,氧化应激可以氧化eNOS的辅酶BH4,导致eNOS发生解耦联,产生NO的活力下降[17].最后,心衰过程中,不对称二甲基精氨酸产生增高,能够竞争性地抑制NOS酶的活性[18].虽然SNP和硝酸甘油等NO供体能够短时间内释放NO,舒张血管,调节冠状动脉血流,改善心脏功能,但长期使用可能会引起可溶性鸟苷酸环化酶sGC发生巯基亚硝基化修饰而失活[19],使NO丧失心血管保护功能.我们发现,SNP在较低浓度就可以抑制心肌细胞活力,较高浓度的L-Arg对心肌细胞的活力有促进作用.这说明直接使用NO供体可能对正常的心肌功能不利,而通过添加L-Arg增加内源性NO的产生,可以提高心肌细胞活力.L-Arg对心衰病人的保护作用在临床实验中也得到一定的证实[20].但L-Arg对心脏肥厚的抑制作用还有一些争论.例如,最近的一项研究发现,在ISO诱导心肌肥厚的模型中,补充L-Arg可以轻微地提高心脏功能,但不能抑制心肌肥厚和心肌纤维化[21],说明单纯补充L-Arg的心血管保护作用还不明显.