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解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2在玉米叶际的定殖能力

中国学术期刊网【农林学论文】 编辑:天问 云南大学学报(自然科学版) 2016-11-04解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2在玉米叶际的定殖能力论文作者:谢兰芬 何鹏飞 吴毅歆 肖春 何月秋,原文发表在《云南大学学报(自然科学版)杂志》,经中国学术期刊网小编精心整理,仅供您参考。

关键词: 定殖; 解淀粉芽孢杆菌; 玉米叶际
摘要:解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2(Y2)是一株具有良好防病功能的菌株.为了明确Y2能否在玉米叶际有效定殖,采用喷雾接种法,考察了其在玉米叶际的定殖能力.结果表明,温室条件下,绿色荧光标记菌株Y2-pHAPⅡ悬浮剂在每天16:00接种时定殖能力最强;同时Y2-pHAPⅡ悬浮剂和Y2-pHAPⅡ菌液的活菌数、菌体数以及芽孢数的消长动态相一致,9天时前者的活菌数、菌体数以及芽孢数出现的峰值分别为5.13×106、3.10×106cfu/g和2.04×106cfu/g,后者峰值分别为3.90×106、2.65×106cfu/g和1.25×106cfu/g;田间条件下Y2悬浮剂和Y2菌液的3种菌落数值变化曲线相类似,5天时前者的活菌数和菌体数分别达4.59×105cfu/g 和2.30×105cfu/g,后者数值为 3.44×105cfu/g和1.72×105cfu/g,12天时二者芽孢数小幅增长至1.17×105cfu/g和4.03×104cfu/g;温室和田间条件下,40天时均能回收到目标菌株,且悬浮剂比菌液提高25%左右的定殖能力.这些结果说明该菌株的良好定殖能力是有效防病可能机制之一.

中图分类号:S476 文献标志码:A 文章编号:0258-7971(2016)05-0827-08 doi: 10.7540/j.ynu.20160085

玉米叶斑病(大斑病、小斑病和圆斑病等)单独或混合不断发生, 给玉米生产带来极大的危害, 并造成很大的经济损失[1].目前针对玉米叶部病害主要采取抗病育种和化学防治措施, 而抗病育种周期较长, 化学防治会导致玉米农药残留超标和环境污染等问题.生物防治因具有环境友好、利于改善农业生态系统等特点而备受关注.国内外有关玉米叶斑病生物防治的研究主要集中于玉米叶斑病菌拮抗菌的筛选及其利用上[2, 3, 4], 尚无商品化的产品.近年来主要利用室内生测筛选生防菌, 但在实际应用中拮抗作用强的生防菌并不一定是最好的生防因子, 拮抗菌能否在目标植株体表定殖是生防菌取得防效的关键[5, 6, 7].有关田间验证防效较好的玉米叶斑病生防菌的定殖机理、定殖能力与接种方式的关系的研究鲜见报道.解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2(以下称Y2)是本实验室从小麦根系土壤中分离到的一株生防菌, 其在大白菜和烟草的根际、根表和根内有良好的定殖能力[8], 其能促进油菜种子萌发[9], 而它良好防治玉米叶斑类病害能力[10]是否与其定殖能力有关?本文主要研究Y2在玉米叶际的定殖能力, 以期为揭示该菌的防效机制和指导田间应用提供理论依据.

1 材料与方法
1.1 供试材料
(1) 供试玉米 会单4号, 温室为5~7叶期, 田间为喇叭口期开始至采样结束;

(2) 温室接种菌株 携带pHAPⅡ 质粒(南京农业大学沈其荣老师馈赠)的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )B9601-Y2菌株(以下简称Y2-pHAPⅡ , 本实验室保存), 能在终质量浓度为30mg/L的卡那霉素LB培养基中生长, 紫外灯照射下呈绿色荧光菌落或菌体;

(3) 田间接种菌株 工厂发酵的野生型Y2;

(4) 抗生素LB液体和平板(加入15g/L的琼脂粉)培养基 抗生素卡那霉素(30mg/L拜尔迪公司产品)培养基用于 Y2-pHAPⅡ 的揺瓶发酵和温室定殖试验菌株的回收;

(5) LB平板 用于田间定殖试验野生型菌株的回收.

1.2 试验方法
1.2.1 喷施菌剂、菌液的制备

(1) 温室菌剂和菌液制备 挑取Y2-pHAPⅡ 单菌落转移至抗生素LB液体培养基中恒温震荡(37℃, 180r/min)培养4d, 芽孢率≥ 95%后取出备用.菌剂:摇瓶发酵液制成50× 108cfu/mL的Y2-pHAPⅡ 悬浮剂(悬浮剂配方见文献[11]), 稀释500倍芽孢浓度为1× 107cfu/mL备用; [转载自中国学术期刊网 http://www.qikanc.com,请保留此标记。]发酵菌液:将揺瓶发酵液调至芽孢浓度为1× 107cfu/mL加入2‰ 黄原胶和5‰ 吐温-80备用.

(2) 大田菌剂和菌液 工厂发酵野生型Y2替换Y2-pHAPⅡ , 其他同(1).

1.2.2 喷药时段对Y2-pHAPⅡ 悬浮剂在玉米叶际定殖能力的影响 在温室中将上述制备好的Y2-pHAPⅡ 悬浮剂于8︰00、10︰00、12︰00、14︰00、16︰00以及18︰00均匀喷施于5叶期玉米叶片上, 以叶面开始有液滴滑落时为准.第0(喷药后叶面刚干燥)、1、3、5、7天用面积为1cm2的打孔器在第4全展叶打取20片, 称重后置于装有20mL无菌水的三角瓶中, 震荡(25℃, 200r/min)30min, 经双层纱布过滤后用无菌水梯度稀释10倍和100倍后取100μ L分别涂布于抗生素LB平板上, 恒温培养(t=37℃)24h后在紫外灯下记录荧光菌落数为活菌数.

1.2.3 温室中Y2-pHAPⅡ 在玉米叶际的定殖能力 将上述制备好的Y2-pHAPⅡ 菌剂和菌液于1.2.2中定殖量最高的时间均匀喷施在5叶期玉米叶片上, 第0、1、3、5、7、9、12、15、18、21、25、30、35、40天分别取样.方法同1.2.2.同时将滤液恒温水浴(80℃, 15min)后稀释后涂布于抗生素LB平板上, 记录菌落数为芽孢数.设置喷施稀释500倍悬浮剂助剂及0.2%黄原胶和0.5%吐温-80分别作为悬浮剂和发酵菌液的对照.

1.2.4 Y2田间定殖能力 将上述制备好的野生型Y2菌剂和菌液在最佳时段均匀喷施于田间大喇叭口期玉米植株上, 喷施标准同1.2.2.用灭菌保鲜袋取第7片全展叶装冰盒带回实验室回收菌体.取样时间同1.2.3.取样方法:取叶片中部称重10.00g后置于装有200mL无菌水的三角瓶中后续操作同1.2.2和1.2.3分别记录活菌数和芽孢数.对照组同1.2.3.

温室和田间所有处理和对照均重复4次.

1.2.5 菌落统计方法 菌落统计结果以cfu/g鲜叶重表示计算公式为:

每克鲜叶的叶际活菌数(或芽孢数)=

菌落数×稀释倍数×10×无菌水量(mL)鲜叶重(g);
每克鲜叶的叶际菌体数=每克鲜叶的叶际活菌数-每克鲜叶的叶际芽孢数.

1.3 数据统计与分析
用SPSS19.0进行单因素方差分析; Excel2007用于图表的制作.

2 结果与分析
2.1 喷药时段对Y2悬浮剂在玉米叶际定殖能力的影响
在温室环境相对稳定条件下利用抗生素LB平板对不同施用时段的Y2-pHAPⅡ 悬浮剂进行回收结果如图1所示.1、3、5、7天和9天连续5次采样的结果均显示定殖能力从高到低依次为16:00> 18:00> 12:00> 14:00> 10:00> 8:00.8:00— 12:00期间随着时间的推移Y2-pHAPⅡ 悬浮剂的定殖能力不断地极显著提高, 以7天的增幅最大从8:00的2.76× 106cfu/g提高至12:00的3.35× 106cfu/g, 提高幅度达21.31%; 12:00— 18:00时间段内Y2-pHAPⅡ 悬浮剂的活菌数在14:00时出现1个低谷而后于16:00时达5次喷施时段的高峰18:00时又稍有下降.


图1
Fig.1
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图1 Y2-pHAPⅡ 悬浮剂不同施用时段在玉米叶际的定殖能力(平均值± 标准差).小写字母表示在α =0.05水平上差异显著, 大写字母表示在α =0.01水平上差异极显著.
Fig.1 The colonization ability of Y2-pHAPⅡ SC in different application periods on maize phyllosphere(Mean± SD).The different lowercase and capital letters mean the different significances at α =0.05 and α =0.01 levels respectively.

2.2 温室中Y2-pHAPⅡ 在玉米叶际的定殖能力
试验期间温室环境条件为日低温20~22℃, 日高温30~35℃, 湿度50%左右, 无风.Y2-pHAPⅡ 悬浮剂的定殖动态如图2所示, Y2-pHAPⅡ 悬浮剂活菌数在玉米叶际的消长动态呈先降后升再降的总体趋势.0天在玉米叶际的初始量为6.76× 106cfu/g, 到5天时下降到3.42× 106cfu/g, 而后开始上升到9天时达到3~40天期间的峰值5.13× 106cfu/g, 维持了初始量的75.88%.此后不断下降到40天, 采样结束时定殖量为1.30× 106cfu/g, 为初始量的19.23%.其芽孢数由于孢子的萌发和死亡随采样时间的推移整体呈不断下降趋势, 由0天的6.49× 106cfu/g下降至40天的1.26× 106cfu/g, 降幅达80.59%, 期间12天时由于生长的菌体转化为芽孢而有小幅上升.其菌体数呈先升后降的趋势, 0天的菌体量为2.78× 105cfu/g, 说明制剂中有4.11%菌体未转化成为芽孢, 1~9天随着芽孢开始在玉米叶际萌发生长菌体量不断升高, 于9天达到采样期间的峰值3.10× 106cfu/g, 占活菌数的64.23%.而后菌体开始死亡或重新转化为芽孢从而不断下降, 21天下降至占活菌数12.00%以下, 至40天时仅占活菌数的2.42%.


图2
Fig.2
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图2 Y2-pHAPⅡ 悬浮剂在玉米叶际的温室定殖动态
Fig.2 The colonization dynamics of Y2 SC on maize phyllosphere in the greenhouse

Y2-pHAPⅡ 发酵菌液活菌数、芽孢数和菌体数3者在玉米叶际的消长动态与悬浮剂相似(图3).活菌数由0天 的5.09× 106cfu/g消减至40天的9.73× 105cfu/g , 芽孢由4.929× 106cfu/g 降至9.63× 105cfu/g.9天时活菌数和菌体数达到的小峰值, 分别为3.90× 106、2.65× 106cfu/g, 数值上与悬浮剂相比分别降低了23.98%、14.52%.两者分别设置的对照组玉米叶际洗脱液中均回收不到任何菌体.


图3
Fig.3
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图3 Y2-pHAPⅡ 菌液在玉米叶际的温室定殖动态
Fig.3 The colonization dynamics of Y2-pHAPⅡ liquid on maize phyllosphere in the greenhouse

2.3 Y2在玉米叶际的田间定殖能力
田间试验在2013年6月28日至8月7日进行, 试验采样期间的0~40天内, 日低温17~19℃, 日高温23~26℃, 湿度52%~90%, 风力1~2级, 8~15天期间每天均有阵雨.

从图4结果可知, Y2悬浮剂喷施到玉米叶片后, 活菌数整体呈先降后升再降的趋势.由0天的6.28× 105cfu/g下降至3天的3.31× 105cfu/g; 而后由于天气多云见阴, 下过零星小雨, 增加相对湿度后, 活菌数于5天升至取样期内的峰值4.59× 105cfu/g ; 7~9天由于受降雨冲刷的影响, 活菌数大幅下降至0.88× 105cfu/g , 降幅达85.99%, 说明雨水冲刷对Y2悬浮剂在玉米叶面上的定殖有显著影响; 18~40天期间, 除25天雨过天晴, 叶面活菌数略有回升, 后一直下降至6.35× 103cfu/g .Y2芽孢数变化动态与前者类似, 9天时芽孢数由 6.02 × 105cfu/g下降至4.73× 104cfu/g , 下降幅度达92.14%, 下降的原因应该是芽孢的死亡、雨水冲刷和萌发等; 12天经历生长代谢的菌体由于环境恶劣重新转变为芽孢后出现一个峰值达1.17 × 105cfu/g ; 18天后与Y2活菌数保持一致, 说明此时玉米叶际的Y2绝大部分以芽孢的状态存在, 生长代谢微弱; 40天时降至5.95× 103cfu/g, 将逐渐淡出玉米叶际微生态环境.菌体数总体呈先升后降的趋势, 说明菌剂中的芽孢在玉米叶片上萌发代谢, 这是Y2生防功能的重要体现.0天的菌体数应该来自制剂本身所携带的; 前5天由于环境条件良好, 菌体数由1天的9.27× 104cfu/g 增加至5天的2.30× 105cfu/g , 增幅达148%; 而后随雨水的冲刷以及菌体到芽孢的转换, 于12天降至4.95× 103cfu/g , 当中大部分转换成芽孢的形式; 12~15天期间晴雨相间, 因部分芽孢再次萌发而菌体数略提高至5.77× 104cfu/g ; 18天后菌体数可忽略不计仅为几百个.


图4
Fig.4
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图4 Y2悬浮剂在玉米叶际的田间定殖动态
Fig.4 The colonization dynamics of Y2 SC on maize phyllosphere in the field

Y2菌液除数值与Y2悬浮剂存在差异外, 活菌数、芽孢数以及菌体数的动态变化与其相似(图5).活菌数和芽孢数分别由0天的4.64× 105cfu/g和4.49× 105cfu/g下降至40天的4.15× 103cfu/g和3.85× 103cfu/g. 5天时活菌数和菌体数的小峰值3.44× 105、1.72× 105cfu/g, 与Y2悬浮剂相较降低了25.27%和25.22%.


图 5
Fig.5
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图 5 Y2菌液在玉米叶际的田间定殖动态
Fig.5 The colonization dynamics of Y2 liquid on maize phyllosphere in the field

由于田间喷施的Y2为野生型, 本试验从菌落形态来区分回收菌株是否为Y2需要确定.结果显示Y2悬浮剂和菌液在玉米叶际洗涤原液稀释10倍LB平板涂布培养后, 可见Y2菌落数量随采样的时间出现动态变化, 且与其他菌落形态的菌株共同生长, 而各自的对照平板中则未见到类似Y2菌落形态的菌株仅生长其他菌落形态的菌株; 各处理水浴后原液涂板LB平板中仅出现Y2菌落形态的菌株, 未发现其他形态的菌株, 对照组未生长出任何菌落形态的菌株, 说明野生型Y2菌株的确能定殖于玉米叶际.

3 讨 论
本文主要研究了Y2在不同施用时间段和剂型下对玉米叶际定殖能力的影响, 以及Y2在田间玉米叶际的定殖动态, 为其防治玉米叶部病害制定合适的施药时间、研制有效剂型以及适时补施以确保有效控制玉米叶部病害提供理论依据.

生防菌施入靶标环境后的生长、繁殖、防效的正常发挥, 受到诸多环境因子的制约, 如温度、湿度、pH、光照、环境微生物等[12].本试验研究了不同施用时段对Y2在玉米叶际定殖能力的影响, 发现8:00— 12:00时段内, 随时间推移定殖能力显著提高, 其原因可能是温度的升高有利于菌株的定殖; 而14:00却出现下降的现象, 此时温度较高, 紫外辐射强度也强, 对菌体有直接的杀伤能力, 从而导致定殖能力的下降; 16:00施用定殖能力最强, 此时温度适宜, 紫外辐射也较弱, 适合菌株的定殖.但Y2在玉米叶际上定殖能力的强弱与施用环境的温度、湿度、紫外辐射等相关性还有待进一步研究.

生防菌在植物体表的定殖能力与防治植物地上部分病害效果关系密切.定殖能力强的生防菌能充分发挥其营养、空间竞争以及代谢抗菌物质抑菌防病[13].本文结合温室和田间定殖试验明确了Y2能在玉米叶际有效定殖, 说明该菌株对玉米叶际的微生态环境有较好的适应性, 是能有效地防治玉米叶斑病[10]原因之一.温室和田间结果表明, Y2活菌数在玉米叶际的定殖消长动态, 与王志远等[8]研究该菌株在作物的根部的定殖能力相符, 说明该菌株不但能在作物根部定殖, 亦能在玉米叶际定殖, 是否能在其他作物叶际定殖有待进一步研究论证; 其田间定殖密度较温室定殖密度下降了1个数量级, 说明田间不断变化的环境对Y2的定殖存在极其显著的影响.

Y2芽孢数的回收为本文的一个创新点, 芽孢作为一种对环境适应能力强的存在形式而成为芽孢杆菌属生防的施用体[14], 而国内学者在芽孢杆菌属定殖报道中从未以芽孢作为回收目标进行回收, 而是以活菌数作为定殖量的标准[15].芽孢在施用环境中能以活菌数被回收并不代表其在环境中出现了生长、繁殖、代谢等过程, 而只有其发生了上述过程才能发挥生防的效果[16], 因此本试验中从回收芽孢数来间接反映正在以菌体形式进行生命代谢活动的生防菌形态.笔者认为菌体数的消长动态才是芽孢杆菌属生防菌真正体现生防作用的群体.本试验结果显示, 菌体在整个采样过程中呈先升后降的趋势, 说明Y2芽孢在适宜的条件下开始萌发, 生长, 代谢, 到达峰值后开始死亡或是继续转变为芽孢, 温室中21天后菌体数可忽略不计.大田试验中18天后绝大都数以芽孢的形式存在, 表明18天后要继续喷施, 使其能保持一定的种群优势, 以确保生防效果.

Y2悬浮剂与Y2发酵液的定殖能力对比可知, Y2悬浮剂能提高25%左右的定殖效果, 在田间施用时效果更加明显, 说明制剂能提高Y2在田间的易粘着、耐冲刷、抗辐射等能力.胡小加等[17]应用丸粒化种衣剂接种枯草芽胞杆菌Tu-100 30天后仍能检测到目标菌株, 而喷雾接种菌液20天后检测不到目标菌株, 说明生防制剂是提高生防菌定殖能力的重要途径.