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以色列野生二粒小麦籽粒多组分营养物质含量的影响因素分析

中国学术期刊网【农林学论文】 编辑:天问 云南大学学报(自然科学版) 2016-11-04以色列野生二粒小麦籽粒多组分营养物质含量的影响因素分析论文作者:詹志杰 薛文韬 阮景军 严俊 赵钢 程剑平,原文发表在《云南大学学报(自然科学版)杂志》,经中国学术期刊网小编精心整理,仅供您参考。

关键词: 野生二粒小麦; 籽粒多组分营养; GPC相关基因; 群体农艺性状
摘要:为丰富小麦的遗传背景、提升小麦的品质,以来自于以色列Hermon地区的110个野生二粒小麦为供试材料,分别于2009年和2014年进行盆栽和田间种植,并测定其农艺性状和籽粒多组分营养成分,以发掘新的基因资源.结果发现,不同种植环境对小麦籽粒的总酚和总类黄酮含量并无显著影响,相关性分析表明,农艺性状与籽粒多组分营养间呈负相关.以与小麦籽粒蛋白质含量 (GPC) 两个基因 GPC-B1和 Fd-GOGAT连锁标记作为单体型 (Haplotype),分析该野生小麦群体,发现此群体在两个标记中有分离.不同单体型组别间比较结果证明,以上两基因不仅可显著影响籽粒可溶性蛋白质和氨基酸含量,还对野生二粒小麦穗长和芒长有明显影响.盆栽与大田种植环境对野生二粒小麦农艺性状及大部分籽粒营养组分有显著影响.

中图分类号:S326 文献标志码:A 文章编号:0258-7971(2016)05-0813-07 doi: 10.7540/j.ynu.20160054

籽粒蛋白质含量 (GPC)是小麦最重要的品质性状之一, 提高小麦GPC是小麦育种重要目标之一.小麦GPC明显受其种植环境等因素影响, 但其0.41~0.70的遗传率[1, 2]仍表明该性状可受遗传控制, 小麦GPC性状属典型的数量性状并由多基因控制.来源于四倍体野生二粒小麦 (Triticum dicoccoides) 的GPC-B1位于染色体6B上, 并被证实对小麦GPC有显著影响[3].该基因属于无顶端分生组织(NAM)转录调控基因家族, 可调控小麦在籽粒发育后期叶片的早衰进程, 并具有转运叶片中的氮素进入种子内部的功能, 从而提高小麦GPC[4].Distelfeld[5]证实GPC-B1与表达序列标签(EST)标记Xuhw89的遗传距离仅有0.1cM.此外, 铁氧化还原蛋白依赖谷氨酰胺合成酶 (ferredoxin-dependent glutamate synthase, Fd-GOGAT, EC 1.4.7.1) 被定位于染色体2A上, 并与SSR标记Xgwm339紧密连锁, 该酶基因 (Fd-GOGAT) 对四倍体硬粒小麦GPC有明显影响[6].与GPC-B1不同, Fd-GOGAT是一种功能基因, 编码氨基酸合成酶, 并且该基因对野生二粒小麦GPC的影响尚无报道.不同种植环境条件改变了农艺性状与籽粒多组分营养物质含量的网络关系, 在田间环境中籽粒多组分营养物质含量呈现出较多的相关性.

野生二粒小麦因其与栽培四倍体小麦的近缘遗传背景, 已被广泛作为育种材料应用于多种性状改良[4].除GPC和微量矿质元素以外[8], 其种子抗氧化物和磷含量的研究相对较少.本研究以来源于以色列Hermon地区的110个野生二粒小麦为研究材料, 分别于2009和2014年在不同环境(四川、贵州)进行盆栽和田间种植, 测定其农艺性状和籽粒营养组分, 比较不同种植环境对其性状的影响; 选择GPC-B1和Fd-GOGAT基因的单核苷酸多态组合作为单体型, 分析其在野生二粒小麦群体中的多态性, 比较两种单体型对农艺性状和籽粒营养组分的影响, 为研究小麦进化和培育小麦新品种提供依据, 对研究小麦农艺性状与籽粒营养组分关系及小麦遗传改良具有重要参考价值.

1 材料与方法
1.1材料
供试材料为110个来源于以色列北部Hermon地区野生二粒小麦, 由以色列海法大学进化研究所提供.

1.2 方法
(1)野生二粒小麦GPC相关基因多样性的鉴定 基因GPC-B1与EST标记Xuhw89紧密连锁[5], Fd-GOGAT与SSR标记Xgwm339紧密连锁[6].标记Xuhw89引物序列为:F1(TCTCCAAGAGGGGAGAGACA), R1(TTCCTCTACCC -ATGAATCTAGCA); 标记Xgwm339引物序列为:F2(AATTTTCTTCCTCACTTATT), R2(AA- ACGAACAACCACTCAATC).小麦DNA的提取采用CTAB法, PCR体系共20μ L, 包括8μ L ddH2O, 6μ L 2× Taq PCR Master Mix(Polymerase 0.1U Tap · μ L-1, 500μ mol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L KCl, 3nmol/L MgCl2), 2μ L DNA和4μ L的引物.PCR扩增程序为, 94℃ 3min, 94℃ 30s, 50(Xuhw89)/58(Xgwm339)℃ 30s, 72℃ 30s, 35个循环, 72℃ 5min.PCR产物由PEGA电泳鉴定.

(2)供试小麦的农艺性状及籽粒营养物质测定 于2009年采用盆栽种植在贵州大学麦作研究中心盆栽试验场, 盆装土10kg, 土壤为50%黄壤和50%营养土(品氏托普), 并混合2g复合肥 (氮磷钾比例为15:15:15)和2g尿素.3个重复, 在培养箱育苗, 待苗有三叶时, 进行移栽, 每盆种植一株.于2014年大田种植于四川省崇州市羊马镇, 条播, 行长1.5m, 每沟播种30粒种子, 行间距60cm.随机区组设计, 重复3次, 设置3行保护行.土壤均为轻质黏土, pH值为7.48, 碱解氮含量为44.5mg· kg-1, 速效磷为19.6mg· kg-1, 速效钾为128.8mg· kg-1, 有机质含量为 17.9mg· kg-1.3~4片叶间苗, 5~6片叶定苗, 适时中耕除草、蹲苗、培土、追肥和浇水, 及时防治病虫害.在小麦成熟期测定株高、穗长、芒长、旗叶长和旗叶宽; 单行收获, 籽粒烘干后研磨、过0.441mm孔径筛备用.分别检测面粉总类黄酮、总酚、植酸和无机磷及α -氨基酸和可溶性蛋白质含量, 重复3次.

(3)籽粒总类黄酮、总酚、植酸和无机磷含量的测定 称取50mg样品, 加入1.6mL甲醇溶液 (50%), 超声1h后65℃恒温水浴1h.10000r/min-1离心10min, 4℃静置48h; 静置后取上清液同时进行籽粒总类黄酮和总酚含量的测定.总类黄酮和总酚含量的测定分别参照Jia[9]和Ainsworth采用紫外分光光度法 [10].

将以上样品剩余物经真空浓缩仪 (Eppendorf, Concentrator Plus) 浓缩6h后至无水, 干燥底物加入1.6mL 0.5mol· L-1的HCl溶液, 并用组织研磨器将底物研磨至匀浆, 10000r/min-1离心10min后, 上清液待测.植酸和无机磷含量的测定分别参照Latta [11] 采用紫外分光光度法.

(4)可溶性蛋白质和氨基酸含量的测定 取30mg样品, 加入1.6mL 0.1mol· L-1的NaOH溶液, 用组织研磨器将底物研磨至匀浆, 85℃恒温水浴1h.13000r/min-1离心15min后, 取上清液, 分别参照 Brown[13] 和 Freedman[14]的方法测定可溶性蛋白质和氨基酸.

1.3 数据统计
运用Sigmaplot 12.0绘制柱状图; 用JMP 6.0进行Student's t 检验; 用R 2.11构建小麦农艺性状与籽粒营养相关性状间的皮尔森相关性矩阵 (Pearson correlation matrix), 并由Cytoscape 2.7.0对相关性矩阵进行相关性网络分析 (correlation-based network analysis, CNA)

2 结果与分析
2.1 不同环境间野生二粒小麦农艺性状及籽粒营养成分的比较
如表1所示, 除总酚和总类黄酮以外, 不同种植环境对野生二粒小麦农艺性状和籽粒营养成分均有极显著影响.2014年田间环境中的可溶性蛋白质平均值在25%左右, 明显高于2009年盆栽环境.同时, 2014年环境中的植酸、氨基酸、芒长和旗叶长也明显高于2009年环境.相反, 2009年环境中的无机磷、株高和穗长明显高于2014年环境.以上结果显示, 盆栽环境中的野生二粒小麦具有较高的植株和较长的旗叶, 但其籽粒有机氮和有机磷水平较大田栽培明显要低.大田种植明显提高野生二粒小麦籽粒蛋白质水平, 但株高相较盆栽环境下降35%.农艺性状穗长-芒长和旗叶长-旗叶宽在两不同种植环境中具有相反的变化趋势.籽粒营养成分植酸-无机磷也在两环境中呈现相反的变化趋势.同一种内的不同品种, 生活在不同的环境条件下, 会形成对多种环境因子的不同耐性范围, 从而形成生态型的分化, 这与基因型起源地的环境差异也有很大的关系.

表1
Tab.1
表1(Tab.1)

表1 不同环境间农艺性状及籽粒营养成分的比较 Tab.1 Comparison of agronomic traits and grain nutrient components between different environments指标 2009年 2014年 显著性
w(可溶性蛋白质)/% 17.18 ± 1.31 24.74 ± 1.70 < 0.001* *
w(植酸)/(g· kg-1) 21.82 ± 3.38 25.12 ± 4.11 < 0.001* *
w(氨基酸)/(g· kg-1) 5.14 ± 1.19 5.82 ± 0.94 < 0.001* *
w(总酚)/(mg· kg-1) 1199.82 ± 316.82 1222.85 ± 310.67 0.5868
w(总类黄酮)/(mg· kg-1) 321.67 ± 46.64 361.32 ± 131.76 0.0633
w(无机磷)/(mg· kg-1) 588.87 ± 145.35 165.87 ± 100.06 < 0.001* *
株高/cm 81.46 ± 7.41 49.43 ± 9.50 < 0.001* *
穗长/cm 9.58 ± 0.96 6.64 ± 1.30 < 0.001* *
芒长/cm 12.43 ± 1.55 15.86 ± 2.60 < 0.001* *
旗叶长/cm 9.82 ± 1.87 12.01 ± 2.67 < 0.001* *
旗叶宽/cm 0.79 ± 0.10 0.57 ± 0.10 < 0.001* *
表1 不同环境间农艺性状及籽粒营养成分的比较
Tab.1 Comparison of agronomic traits and grain nutrient components between different environments
2.2 野生二粒小麦农艺性状与籽粒营养成分间的相关性分析
图1A和1B分别代表2009年和2014年两个环境中野生二粒小麦农艺性状与籽粒营养成分的网络相关性, 图1C表示两个环境中所有数据的相关性分析.以上相关性网络均显示农艺性状与种子营养成分之间主要为负相关.在2009年环境中, 可溶性蛋白质与氨基酸呈现正相关, 相关系数为0.721, 可溶性蛋白与旗叶长、宽呈负相关, 相关系数为-0.355和-0.284; 而在2014年环境中, 微量营养成分总类黄酮与总酚、无极磷有显著正相关, 相关系数为0.593、0.345, 而总酚与株高、芒长呈显著负相关, 相关系数为-0.329和-0.349.以上结果表明不同种植环境中相关性网络会发生改变.在两环境的综合数据中, 抗氧化物总酚和总类黄酮与其他性状关联较少; 可溶性蛋白质、氨基酸与农艺性状主要呈现负相关.可溶性蛋白质与芒长呈现正相关; 穗长与芒长也呈现出负相关.源自不同地区或同一地区不同微域的野生二粒小麦, 由于环境气候因素的差异, 在长期适应其起源地生态地理条件过程中, 通过自然选择, 演化产生出不同特征的群体和基因型, 这为研究小麦进化和培育现代小麦品种提供了依据.


图1
Fig.1
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图1 不同环境中野生二粒小麦农艺性状及籽粒营养组分的相关性网络.(A:2009年农艺性状与籽粒营养成分相关性; B:2014年农艺性状与籽粒营养成分相关性; C:2009, 2014年农艺性状与籽粒营养成分综合相关性.点与点之间的连线代表性状之间的相关性, 实线代表正相关, 虚线代表负相关)
Fig.1 Correlation based network of agronomic traits and grain nutrient components from different environments(The edges between nodes indicate positive and negative correlations by solid and dotted lines)

2.3 不同GPC基因在野生二粒小麦群体中的分离
与两GPC基因连锁的标记Xuhw89和Xgwm339的PCR结果如图2所示.其中Xuhw89隐性基因可扩增126bp(已测序)的片段, 本文中的对照品种六倍体小麦贵紫4号、贵农19号与四倍体小麦Langdon均为Xuhw89隐性基因型.而Xuhw89显性基因型可扩增122bp(已测序)的片段, 如图2A中的野生二粒小麦基因型HP16和HP17.该标记的显、隐性分别用D和R标记.如图2B所示, Xgwm339的所有野生型的扩增片段均与对照四倍体栽培小麦(Svevo)不同.根据其片段多态性将片段较大的基因型命名为A型(166bp), 片段较小的基因型命名为B型(145bp).


图2
Fig.2
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图2 标记、Xuhw89和Xgwm339的PCR电泳图.
Fig.2 PCR electrophoresis of marker of 、Xuhw89 and Xgwm339

根据以上两标记在野生二粒小麦110个基因型的扩增结果, 可将该110个基因型分为8个单体型(HAP) , 如表2所示.其中HAP1共有86个基因型, 该组别属于GPC-B1的显性基因型, 说明大部分野生二粒小麦基因型含有该显性基因; 而该群体中仍然有24个基因型属隐性基因型, 并标记为HAP2.该标记在此小麦群体中的分离比为3.6:1.而在与基因Fd-GOGAT连锁的标记结果中, HAP3包含92个基因型, 说明该群体大部分基因型在标记上Xgwm339为A型; 而属B型的HAP4含有18个基因型.该野生小麦群体在此标记上的分离比为5.1:1.两基因单体型组合结果可分为HPA5-HAP8四个组别.其中HAP5含有79个基因型, 为两基因单体型重叠的基因型; 而HAP6、HAP7和HAP8分别仅含有13、7和11个基因型.

表2
Tab.2
表2(Tab.2)

表2 野生二粒小麦群体不同GPC基因的单体型组合 Tab.2 The haplotype combination of GPC genes from wild emmer wheat population单体型组别 基因型 标记
Xuhw89 标记
Xgwm339
HPA1 86 D —
HPA2 24 R —
HPA3 92 — A
HPA4 18 — B
HPA5 79 D A
HPA6 13 R A
HPA7 7 D B
HPA8 11 R B
表2 野生二粒小麦群体不同GPC基因的单体型组合
Tab.2 The haplotype combination of GPC genes from wild emmer wheat population
2.4 不同单体型组别对野生二粒小麦农艺性状和籽粒营养成分的影响
通过对不同单体型组别间农艺性状以及籽粒营养组分的比较(图3), 仅穗长、芒长、氨基酸和可溶性蛋白质呈现显著性.在2009年环境中, 氨基酸、穗长和芒长在不同单体型组别间具有显著性差异, 而2014年环境中仅可溶性蛋白质和芒长具有显著性差异.在氨基酸的比较结果中, HAP2、HAP4、HAP6、HAP7和HAP8组别的氨基酸显著高于HAP1、HAP3和HAP5.可溶性蛋白质的结果几乎相反, HAP1、HAP3、HAP5和HAP7的蛋白质含量明显高于其他组别.氨基酸与蛋白质的结果主要差异在组别HPA7上, 该组别为GPC-B1的显性基因组合Fd-GOGAT-B型的基因型.在氨基酸的结果中, HAP7与HAP6、HAP8有相似的结果; 在蛋白质结果中, HAP7与HAP5结果类似.以上结果说明, Fd-GOGAT对野生二粒小麦籽粒氨基酸含量有加性效应; 可溶性蛋白质含量主要受GPC-B1影响, Fd-GOGAT并无显著加性效应.穗长与可溶性蛋白质的结果完全相反, HAP2、HAP4、HAP6和HAP8的穗长明显高于其他组别.2个环境芒长在不同单体型组别间均显示显著性差异, 并具有相同的差异趋势; 而这种差异趋势与氨基酸相反, HAP1、HAP3和HAP5明显高于其他组别.


图3
Fig.3
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图3 不同HAP组别间农艺性状及籽粒营养组分的比较(不同字母代表显著性差异P< 0.05(Student′s t检验))
Fig.3 The comparison on agronomic traits and grain nutrient components among different HAP groups(The different alphabets refer to the significant differences p< 0.05 (Student's t test)

3 讨 论
3.1 种植环境对野生二粒小麦农艺性状及籽粒营养组分的影响
盆栽与大田种植环境对野生二粒小麦农艺性状及大部分籽粒营养组分有显著影响, 其中籽粒氮素水平在两环境间存在较大差异.田间种植不仅同时显著提高了籽粒可溶性蛋白质和氨基酸水平, 还提高了有机磷和植酸的含量, 但该种植环境差异对总酚及总类黄酮并无显著影响.总酚和总类黄酮属抗氧化物, 主要合成于种子发育后期, 该类化合物并未受到环境的显著影响, 表明其合成代谢途径具有保守性.在磷素营养中, 种子内60%的磷元素为有机磷, 仅有8%的磷为无机磷[15], 植酸和无机磷在不同环境中呈现相反趋势, 说明较高的有机磷含量会降低游离无机磷含量.同时, 穗长-芒长和旗叶长-旗叶宽也呈现出竞争关系, 说明野生二粒小麦总穗长和旗叶面积具有一定的上限, 不同环境可改变穗长/芒长和旗叶长/旗叶宽比例.不同种植环境改变了农艺性状与种子成分的网络关系, 在田间环境中微量营养呈现出较多的相关性.广泛的遗传变异是作物遗传改良的基础, 不同年份 、不同环境条件 、不同栽培措施, 对小麦农艺性状及大部分籽粒营养组分, 尤其对蛋白质含量有强烈影响.野生二粒小麦中的GPC-B1基因编码1个NAC转录子(NAM-B1).该转录子能加速植株衰老并促进营养物质从叶片到籽粒的转运, 而现代小麦品种中携带的是NAM-B1非功能性的等位基因.本研究对于今后研究小麦等谷类农艺性状及大部分籽粒营养组分及遗传改良具有重要意义和参考价值.