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低氧预处理对大鼠子宫内膜异位病灶的影响

中国学术期刊网【临床医学论文】 编辑:求知 南方医科大学学报 2016-11-10

子宫内膜异位症指子宫内膜上皮和间质在宫腔以外的部位生长,所引起的疾病。EMs是育龄女性常见病之一,可导致月经紊乱、痛经、性交疼痛及不孕,甚至有可能发生恶变,严重影响了女性的生活质量。低氧预处理可通过激活HIF-1α/VEGF体系,促进移植病灶内血管生成;并通过上调Bcl-2抑凋亡因子表达,抑制移植病灶组织细胞凋亡,并促进其增殖,从而促进移植病灶的生长。以下是中国学术期刊网小编为您整理的低氧预处理对大鼠子宫内膜异位病灶的影响论文相关文献,供您阅读。

低氧预处理对大鼠子宫内膜异位病灶的影响

关键词: 子宫内膜异位症 低氧 大鼠 血管内皮生长因子 凋亡
摘要: 目的 了解低氧预处理(hypoxic preconditioning, HPC)对子宫内膜异位症(EMs)大鼠模型异位病灶形成的影响,藉此进一步阐明EMs发生发展的分子机制,从而为其防治供新思路。 方法 Lewis雌性大鼠随机分为两组,分别给予HPC(8% O2)和常压常氧(21% O2)处理8 h,随即取其子宫组织移植至正常大鼠腹壁。术后14 d记录移植灶体积,并采用ELISA、免疫组化、Westernblot、RT-PCR和Tunnel法,对血清和腹腔液以及移植前子宫组织和移植病灶进行检测。 结果 HPC可显著上调大鼠子宫血管内皮生长因子(VEGF)mRNA(P < 0.01),并增加其低氧诱导因子(HIF)-α(P < 0.01)表达;与未经HPC的比较,由经HPC的子宫组织所形成的移植病灶体积显著增大(P < 0.01),组织细胞凋亡率减少(P < 0.01),VEGF mRNA上调(P < 0.01),HIF-α(P < 0.01)、VEGF(P < 0.05)、CD31(P < 0.01)、Ki67(P < 0.01)及Bcl-2(P < 0.05)表达均明显增加;且移植了经HPC子宫组织的大鼠血清及腹腔积液VEGF含量也明显增加(P < 0.01)。 结论 HPC可通过激活HIF-1α/VEGF体系,促进移植病灶内血管生成;并通过上调Bcl-2抑凋亡因子表达,抑制移植病灶组织细胞凋亡,并促进其增殖,从而促进移植病灶的生长。基于此,我们推测对于EMs高风险对象或复发患者而言,避免其在位内膜组织反复接受低氧刺激,以及内膜组织脱落前即人为干预抑制HIFs/VEGF体系活化,有望成为控制EMs发生发展的措施之一。

子宫内膜异位症(EMs)指子宫内膜上皮和间质在宫腔以外的部位生长,所引起的疾病。EMs是育龄女性常见病之一,可导致月经紊乱、痛经、性交疼痛及不孕,甚至有可能发生恶变,严重影响了女性的生活质量[27]。目前,EMs的确切病因及发病机制尚未完全明确。由于EMs属雌激素依赖性疾病,现有的治疗方法主要通过药物阻断雌激素供给而使病灶萎缩,或通过手术彻底清除病灶。但停药后EMs往往复发迅速,术后2年复发率甚至高达40% [25],可见现有的以EMs病灶为靶点的治疗方法有效性不高、费用高且副作用大。因此亟待通过进一步对EMs发病机制的研究,以寻求新的治疗思路。

近年来有研究提出“在位内膜决定论” [1],认为EMs患者的在位内膜与正常女性的在位内膜存在本质不同,其脱落后具有更强的生存、增殖能力,从而更易形成异位病灶,因此EMs的启动部位应该是子宫。相关的动物研究由此展开,越来越多的研究结果证实,在位的子宫内膜经缺氧刺激后,其生理功能会发生一定改变,当其随月经脱落并逆流入盆腔后,更能适应盆腔的缺氧环境,从而更易存活、异位粘附和种植,并形成异位病灶[2-5]。

低氧预处理(hypoxic preconditioning, HPC)指在组织细胞面临致死性低氧前,先给予数小时或数天的非致死性低氧处理,使细胞获得低氧保护性机制以抵抗致死性应激,这一方法最初应用于心肌缺血再灌注的研究,由于HPC对细胞的保护作用具有普遍性,故而逐步扩展到神经保护及其它领域的研究[6-9]。目前关于HPC对在位子宫内膜影响的研究则较为罕见,且在大部分相关实验研究中[2-4],移植物与移植受体多为非同种属动物,而经手术切除获得的EMs患者内膜组织也已失去血供,无法准确反映其正常生理状态。为此,本研究将通过EMs同种异体移植动物模型,了解HPC对在位内膜及异位病灶形成的影响,进一步明确低氧与EMs发生的关联并初步探讨其分子机制,从而为EMs的治疗提供实验依据和新思路。

1 材料和方法

1.1 动物分组

8~10周龄雌性Lewis大鼠30只,体质量208±19 g,购自并饲养于解放军总医院动物中心。室内12 h昼夜交替,室温24 ℃,相对湿度40%~60%,大鼠可自由进食水。本实验设计已通过解放军总医院动物中心伦理委员会审核。

大鼠以3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉后切除双侧卵巢,每日肌肉注射苯甲酸雌二醇(0.2 mg/kg)(天津金耀)直至实验结束。术后14 d,动物随机分为4组,其中常氧预处理组(Pre-Con)和低氧处理组(Pre-HPC)每组3只动物,常氧移植组(Con)和低氧移植组(HPC)每组12只动物。

1.2 低氧预处理

动物实验用低氧舱由解放军总医院动物中心提供,将Pre-HPC组大鼠置于舱中,舱内温度23 ℃,湿度50%;逐渐调节舱内压力,使舱内氧含量为6%~8%(相当于海拔6000 m),持续8 h。Pre-Con组大鼠置于同样温湿度的常氧环境内8 h。

1.3 EMs动物模型建立

Pre-Con组大鼠麻醉后,取出双侧子宫角,置于盛有DMEM(Gibco, USA)和青链霉素混合液(索莱宝,中国)的培养皿中,将子宫角完全剖开,并剪成内膜面积约5 mm×5 mm的组织块。Con组大鼠麻醉后,在下腹中部纵向切开皮肤约2 cm,逐层进入腹腔,分别于切口两侧腹壁表面,距切口2 cm处,以3-0丝线1针缝合上述子宫组织块1块,并使子宫内膜面贴合腹腔壁表面,常规缝合术口。Pre-HPC组大鼠子宫角组织参照上述方法移植入HPC组大鼠腹腔。术后各组大鼠连续3 d注射青霉素钠(5U/只, i.m.)抗感染。

术后观察见大鼠术口均无异常,精神状态好、活动灵活、进食水正常。

1.4 样本采集

Pre-Con、Pre-HPC组用于移植后剩余的子宫组织-80 ℃冻存待用。Con及HPC组大鼠,在移植手术完成后14 d,常规麻醉,切开腹壁充分暴露移植病灶,以游标卡尺测量病灶最长及最短直径;随后切除病灶,一半置于4%中性多聚甲醛,用于制作石蜡切片,另一半以生理盐水冲洗后,-80 ℃冻存待用;腹主动脉取血并留取腹腔积液,2000 r/min离心3 min,取上清-80 ℃冻存待用。

1.5 ELISA法检测大鼠血清和腹水血管内皮生长因子(VEGF)、TNF-α含量,以及移植病灶Bcl-2、Bax含量

将冻存的血清及腹水以生理盐水10倍稀释作为待测样本;将冻存的移植前子宫组织及移植病灶组织称重后置于生理盐水中,以超声仪(XO-1200,先欧科技,China)充分裂解为5%的组织悬液,2000 r/min离心3 min,取上清作为待测样本。参照Elisa试剂盒(上海哈灵生物, China)说明书,依次加样、孵育及显色后,上酶标仪(Model550, BIO-RAD, USA)在450 nm处检测各孔吸光值,根据标准孔浓度及吸光值,绘制标准曲线,随后计算出各样本对应浓度。

1.6 免疫组织化学法检测移植病灶CK18、SMA、CD31、VEGF、Ki67表达

移植病灶行常规石蜡制片,切片脱蜡至水,经EDTA(pH9.0)微波修复后,以3% H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min,3% BSA室温封闭30 min,一抗(CK18 SMA VEGF, 谷歌生物, China. CD31, Santa Cruz, USA. Ki67, abcom, USA.)4 ℃孵育过夜,PBS浸洗,二抗(DAKO, Denmark)室温孵育60 min,PBS浸洗,DAB(索莱宝,China)显色,苏木素复染后常规脱水、透明、封片,光镜下观察。

Ki67染色切片在400×光镜下随机取6个含有上皮组织的视野拍照,计数所有视野中上皮细胞总数及阳性细胞数,计算得到每张切片的阳性细胞百分比。VEGF染色切片在200×光镜下随机取3个视野拍照,图像采用CMIAS软件(Beijing University of Aeronautics and Astronautics, China)进行分析,得到每个视野中对应抗原表达的面密度并求出均值。

1.7 Tunnel法检测移植病灶组织细胞凋亡

移植病灶石蜡切片脱蜡至水,参照Tunnel检测试剂盒(索莱宝,中国)说明书,切片依次以2%过氧化氢浸泡10 min,20 μg/mL蛋白酶K浸泡15 min,PBS浸洗,TdT酶缓冲液浸泡10 min,滴加TdT酶反应液37 ℃孵育1 h,反应终止液浸泡5 min,PBS浸洗,Streptavidin-HRP室温孵育30 min,PBS浸洗,DAB显色,常规脱水、透明、封片,光镜下观察。每张切片在200×光镜下随机取3个视野拍照,图像采用CMIAS软件进行分析,得到每个视野的面密度并求出均值。

1.8 Western boltting检测原位子宫和移植病灶中VEGF、HIF-1α表达

常规提取移植前子宫组织及移植病灶组织总蛋白,采用BCA法(碧云天)蛋白定量,以4×上样缓冲液稀释(碧云天)后95 ℃热变性15 min后作为样本。样本上样量50 μg,12% SDS-PAGE电泳,转PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,TBS-T浸洗,以HIF-1α、VEGF、β-actin(谷歌生物,Chian)一抗4 ℃孵育过夜,TBS-T浸洗,以HRP标记的二抗(Bioworld, USA)室温孵育1 h,TBS-T浸洗,ECL发光液显色(Bioworld, USA),随后以凝胶扫描成像及图像分析系统(SCA/fluorCho, Alpha Inotech, USA)观察拍照,并对结果进行图像分析。

1.9 RT-PCR检测原位子宫和移植病灶VEGF mRNA表达

移植前子宫组织及移植病灶组织经液氮充分碾磨后,加入Trizol reagent(Invitrogen, USA)常规提取RNA。引物信息为:VEGF-forward 5'-ACCATGAAC TTTCTGCTC-3';VEGF-reverse 5'-GGACGGCTTGA AGATATA-3';β-actin-forward 5'-GGAGATTACTGC CCTGGCTCCTA-3';β-actin-reverse 5'-GACTCATCG TACTCCTGCTTGCTG-3'。随后配置A液:样本RNA 9 μL,加入Random primer 1 μL,70 ℃金属浴5 min,立即0 ℃冷却5min;B液:采用Goscript Reverse Transcription system(Promega, USA),参照说明书,配制10 μL Reverse Transcription mix;混合A、B液,25 ℃退火5 min,42 ℃延伸1 min,70 ℃灭活逆转录酶5 min,完成cDNA合成。随后采用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA)配制反应体系,设定仪器7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, USA) 40个PCR循环(95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min)进行扩增,并读取各样本目的基因和内参基因的Ct值,随后计算出目的基因相对表达量,每个样本进行3个复孔实验,取均值作为该样本目的基因表达量。

1.10 统计学分析

数据以均数±标准差表示,采用SPSS17.0软进行单因素及两因素方差分析,以P < 0.05认为差异具有统计学差异。

2 结果

2.1 HPC可增加大鼠血清及腹腔液中VEGF含量

统计结果显示,HPC组大鼠的血清(n=12, df=1, F=89.320, P=0.000)及腹腔液(n=12, df=1, F=4.964, P=0.036)中VEGF含量均显著高于Con组;但血清(n=12, df=1, F=0.142, P=0.710)及腹腔液(n=12, df=1, F=0.001, P=0.971)TNF-α含量未见改变(图 1)。

图 1(Figure 1)
图 1 HPC对大鼠血清及腹腔液中VEGF和TNFa含量的影响

Figure 1 Changes of VEGF and TNF-α levels in serum and peritoneal fluid after hypoxia pretreatment. vs Con, **P < 0.01, *P < 0.05, n=12.

2.2 移植病灶具有与EMs一致的形态结构及生理表现

移植术后14 d,大鼠腹腔移植处均形成单个囊泡状病灶,囊泡基底及表面均可见血管形成,内含清亮液体。免疫组化CK18、SMA、CD31染色结果显示(图 2),病灶囊壁内表面为一层子宫内膜腺样上皮(CK18 +++),囊壁及基底组织内可见大量血管(CD31+++)及平滑肌组织(SMA+++)分布;囊腔内可见炎性细胞。上述移植病灶组织形态结构符合EMs病变,提示建模成功。

图 2(Figure 2)
图 2 大鼠移植病灶免疫组化鉴定

Figure 2 Immunohistochemical staining of CK18, SMA and CD31 in endometriotic implants. The lesions show a dilated endometrial glands surrounded by stroma. E: Endometrial gland; S: Endometrial stroma; M: Muscle.

2.3 HPC可增加移植病灶体积

根据测量所得病灶最短和最长直径,应用公式:体积(mm3)=л/4×a2×b(a为病灶最短直径,b为最大直径),计算出病灶体积。单因素方差分析结果显示,HPC组移植病灶体积较Con组显著增大(n=12, df=1, F=8.404, P=0.008,图 2)。

2.4 HPC可增加大鼠移植病灶VEGF、Ki67表达

免疫组化染色结果显示,HPC组病灶囊壁及基底组织大量血管内皮增生,VEGF呈强阳性(+++)表达,上皮Ki67阳性细胞率约为25%;Con组病灶也可见新生血管形成,但VEGF阳性程度较弱(++),上皮Ki67阳性细胞率约为10%(图 3、4)。图像分析及单因素方差分析结果显示,HPC组病灶VEGF(n=12, df=1, F=5.539, P=0.028)、CD31(n=12, df=1, F=10.175, P=0.004)表达均较Con组显著增强,其上皮Ki67阳性细胞数量也显著多于Con组(n=12, df=1, F=59.831, P=0.000)。以上结果提示,HPC有可能通过促进移植病灶组织血管生成及细胞增殖,从而促进移植病灶的生长。

图 3(Figure 3)
图 3 HPC对移植病灶体积的影响

Figure 3 Changes of the volume of ectopic endometriotic implant after hypoxia pretreatment. **P < 0.01, n=12.

图 4(Figure 4)
图 4 HPC对移植病灶VEGF、Ki67表达的影响

Figure 4 VEGF and Ki67 expression of ectopic endometriotic implant after hypoxia pretreatment. vs Con, **P < 0.01, *P < 0.05, n=12.

2.5 HPC可减少移植病灶细胞凋亡发生

Tunnel检测结果显示(图 5),镜下可见Con组病灶约10~15%细胞发生凋亡,HPC组凋亡细胞较Con组少。单因素方差分析结果显示,HPC组移植病灶Tunnel染色切片面密度显著低于Con组(n=12, df=1, F=47.000, P=0.000)。

图 5(Figure 5)
图 5 HPC对移植病灶组织细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响

Figure 5 The VEGF, CD31, Ki67 expression of ectopic endometriotic implant after hypoxia pretreatment. vs Con, **P < 0.01, *P < 0.05, n=12.

ELISA检测结果显示(图 5),HPC组移植病灶Bcl-2表达较Con组显著上调(n=12, df=1, F=5.778, P=0.025),此外尽管二者Bax表达无显著差异(n=12, df=1, F=3.246, P=0.085),但HPC组Bcl-2/Bax比值较Con组显著增加(n=12, df=1, F=7.832, P=0.010)。以上结果提示,HPC有可能通过上调抑凋亡因子Bcl-2表达,从而减少移植病灶组织细胞凋亡发生。

2.6 HPC可上调原位和异位内膜及其间质组织中VEGF mRNA表达,并增加低氧诱导因子(HIF)-1α、VEGF表达

检测结果显示(图 6),经HPC 8 h后,大鼠子宫组织HIF-1α表达显著增高(n=12, df=1, F=47.107, P=0.002),同时VEGF mRNA显著上调(n=12, df=1, F=12.812, P=0.023),但VEGF表达未见著变(n=12, df=1, F=12.812, P=0.097);移植术14 d后,与由移植未经HPC子宫组织形成的移植病灶比较,由HPC组织形成的移植病灶组织中VEGF mRNA显著上调(n=12, df=1, F=10.136, P=0.004),且VEGF(n=12, df=1, F=52.817, P=0.000)、HIF-1α(n=12, df=1, F=96.674, P=0.000)表达均显著增加。

图 6(Figure 6)
图 6 HPC对大鼠子宫和移植病灶HIF-1α、VEGF及VEGFmRNA表达的影响

Figure 6 VEGF, VEGF mRNA and HIF-1α expression in ectopic endometriotic implant of pre-transplantation and pro-transplantation. vs Con, **P < 0.01, *P < 0.05, before hypoxia pretreatment n=3, after hypoxia pretreatment n=12.

进一步的两因素方差分析结果提示,尽管HPC与移植术两因素间未见显著相互作用,但对原位和异位内膜及其间质组织而言,HPC均可显著上调其中VEGF mRNA(df=1, F=11.968., P=0.002),并增加HIF-1α(df=1, F=75.197, P=0.000)、VEGF(df=1, F=30.368, P=0.000)表达。此外,对无论是否经HPC的子宫内膜及其间质组织而言,由其形成的移植病灶VEGF mRNA(df=1, F=30.381, P=0.000)、VEGF(df=1, F=28.623, P=0.000)、HIF-1α(df=1, F=26.542, P=0.000)表达均较原位组织显著上调。

赵军1,2, 刘肖3, 李亚里1, 谭明华1
1. 解放军总医院妇产科, 北京 100039 ;
2. 海军总医院妇产科, 北京 100048 ;
3. 海军总医院病理科, 北京 100048
收稿日期:2016-07-02
作者简介:赵军, 博士研究生。
通信作者:李亚里, 教授,

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