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低硒饮食对大鼠肝肾中CD163、CD206、CCR7的影响

中国学术期刊网【临床医学论文】 编辑:天问 南方医科大学学报 2016-11-10
低硒饮食对大鼠肝肾中CD163、CD206、CCR7的影响论文作者:王丽云 易建华 徐航超 吴晓芳 李丹阳 韩晶,原文发表在《南方医科大学学报杂志》,经中国学术期刊网小编精心整理,仅供您参考。

关键词: 硒 肝脏 肾脏 纤维化 巨噬细胞极化
摘要: 目的 探讨低硒饮食对大鼠肝肾的影响,以及巨噬细胞向M1、M2的极化在肝肾纤维化中的作用。 方法 利用低硒和正常饲料分别喂养大鼠,建立低硒动物模型。将12只雌性与12只雄性SD大鼠按随机数字表法分成2组:对照组(Z组,饲料硒0.18 mg/kg)、低硒组(S组,饲料硒0.02 mg/kg),饲养109 d后处死大鼠,HE染色观察肝肾病理改变,免疫组化采用SP法染色检测肝肾组织中CCR7、CD206、CD163阳性细胞数量。 结果 (1)低硒组大鼠肝肾纤维化较对照组严重;(2)雌雄大鼠肝脏低硒组CCR7、CD206染色强度与对照组(雌性、雄性、雌性、雄性,P均>0.05)相比较均无统计学差异。CD163染色强度低于对照组(雌性、雄性P均 < 0.05),有统计学意义;(3)雌雄大鼠肾脏低硒组CCR7染色强度在近球小管略高于对照组(雌性、雄性P均>0.05),在远球小管中略低于对照组(雌性P>0.05、雄性P < 0.05),然而结果均无统计学差异;CD163染色强度在远球小管中低于对照组(雌性、雄性P均 < 0.05),CD206染色强度在近球小管中高于对照组(雌性P、雄性P均 < 0.05),有统计学意义;CD163染色强度在近球小管中低于对照组(雌性P>0.05、雄性P < 0.05),雌性无统计学意义,雄性有统计学意义,CD206染色强度在远球小管中高于对照组(雌性P < 0.05、雄性P>0.05),雌性有统计学意义,雄性无统计学意义。 结论 低硒组大鼠肝肾出现了明显的纤维化,同时低硒可能抑制巨噬细胞向M2型极化。

巨噬细胞是一种重要的免疫细胞,由骨髓中造血干细胞来源的单核细胞分化而来。巨噬细胞根据激活方式区分有两种,分别是经典途径激活的巨噬细胞(M1)和非经典途径激活的巨噬细胞(M2)。M1/M2比例及M2的绝对数量对许多疾病的病情和愈后有很大的预测作用[1],因此,若能完全了解巨噬细胞的极化过程及其影响因素,在关键环节进行调控,扭转疾病中已经发生的极化失衡,不失为治疗多种免疫相关疾病的新思路。但有关硒对巨噬细胞极化作用尚不全面,研究低硒对巨噬细胞极化过程影响,并进一步探讨其免疫机制将对理解众多免疫相关疾病的发生发展规律和治疗都有重要意义。

然而在这方面,有关硒对巨噬细胞极化尚不全面。有研究表明,使用活性维生素D调节糖尿病大鼠巨噬细胞极化来保护足细胞治疗肾病[2],并取得了良好的效果,而巨噬细胞表面分子表达也与肝癌患者疾病严重程度与预后有关[3]。M1型巨噬细胞活化后,其表面分子CCR7、CD80、CD86表达增加,M2型巨噬细胞激活后其表面分子CD206、CD163表达增加[4-5]。微量硒可能诱导巨噬细胞活化表型开关可选择地从经典激活M1朝向激活M2表型[6],但当前低硒与肝肾巨噬细胞极化的机制并不清楚。

在人体内,硒参与构成谷胱甘肽过氧化物酶,谷胱甘肽过氧化物酶参与众多的生化反应,主要处理亲水性过氧化物,防止脂质过氧化,从而起到保护生物膜,抗氧化的作用。缺硒会使细胞氧化还原电位失衡,导致人体内氧化自由基过多而造成细胞组织损伤。糖尿病、动脉粥样硬化、白内障、克山病等许多与氧化应激相关疾病都与缺硒密切相关。本课题组筛选出具有特异性的巨噬细胞表面分子CD163、CD206、CCR7,旨在通过建立动物模型,研究这些巨噬细胞表面分子表达的差异性进而推测低硒对巨噬细胞极化方式的影响,并判断低硒与大鼠肝肾纤维化的关系。对揭示硒对人体免疫过程的影响有重要意义。

1 材料和方法

本研究通过使用不同含硒量的饲料饲养SD大鼠来构建动物模型。实验分为两组:分别是喂食低硒饲料的实验组和喂食标准饲料的对照组。通过病理切片染色观察低硒组肝脏和肾脏损伤和纤维化情况。免疫组化实验分别选取CCR7作为M1型巨噬细胞的特异标记物,CD163和CD206作为M2型巨噬细胞的特异性标记物。通过SP法免疫组化染色测定CCR7、CD206、CD163在所有大鼠肝肾中的表达情况,根据标记的M1、M2数量差别,探讨硒对巨噬细胞极化过程的影响,及其在缺硒引起的肝肾纤维化中的作用

1.1 组织来源及处理

出生18 d SD大鼠24只(西安交通大学动物实验中心提供),体质量30.09±3.04 g,雌雄各半。大鼠在25 ℃,相对湿度65%,12 h光/暗周期下饲养。在实验开始前,所有大鼠均健康,无疾病和损伤,采用随机数字表法将大鼠分成2组(雌雄各6只)。Z组使用标准饲料喂养(含0.18 mg/kg硒)作为对照,S组使用低硒饲料喂养(0.02 mg/kg硒),饮用水为去离子水。所有大鼠饲养109 d后取材:大鼠按1 g/100 g体质量用10%水和氯醛麻醉后,取肾脏和肝脏置于4%多聚甲醛,然后进行常规石蜡包埋。包埋后置于-20 ℃冰箱。使用Leica RM 2235切片机手动切片,切片厚度6 μm。切下的组织切片用毛笔带至37 ℃水浴箱,用平轻轻展开,载玻片捞起,置于60 ℃烘箱烘烤1 h,烘箱内冷却过夜待用。

1.2 HE染色

取低硒组与对照组大鼠肝脏和肾脏切片,二甲苯脱蜡,苏木素染色8~10 min,2%盐酸酒精,2%伊红染色1~2 min,80%、90%、100%酒精逐级脱水各2 min,100%二甲苯洗3次,5 min/次,塑胶封片固定。

1.3 免疫组化染色

取低硒组与对照组大鼠肝脏和肾脏切片,二甲苯常规脱蜡,梯度酒精脱水,0.3%过氧化氢冲洗,磷酸盐缓冲液(PBS)振洗5 min×3次。滴加封闭血清A,置于37 ℃孵育20 min,倾去,勿洗,滴加兔来源一抗(1:200稀释),4 ℃冰箱中过夜。

取出切片,室温平衡30 min,PBS冲洗3次×3 min。滴加试剂B,置于37 ℃烘箱中20 min,PBS洗3次× 3 min。滴加试剂C,置于37 ℃孵育20 min,PBS洗3次×3 min。用DAB呈色,清水冲洗,细胞核用苏木素复染,中性树脂封片。

1.4 统计学处理

染色后,采用BX5正置荧光显微镜(奥林巴斯),采集200倍图像,像素为1200×1600,每个样本随机采集不重复图像,每组每抗体选取雌雄各选3个样本。采集图像选取每只大鼠肾样本近球小管和远球小管各5个,肝样本肝小叶区域5个。运用Image J图片分析软件对采集图像中的阳性像素点数量进行统计计算。(1)将导入的彩色图像转化为灰度图像:进入Image菜单并点击“Type”选项卡,选择“RGB stack”选项从而将图像分割为红、绿、蓝频道,浏览3个频道的图像后,鉴于蓝色分离度最佳,选取该频道的图像;(2)进入Image菜单并点击“Adjust”选项卡,并使用“Threshold”工具分离阳性染色区域,并持续调整阈值直至阳性染色区域呈现红色高亮,所有图像使用同一阈值;(3)对于这些满足阈值的区域按如下步骤进行:进入“Analyze”下的“Set Measurement”并检查“Area”,“Area fraction”,“Limit to threshold”,当点击“Analyze”菜单下的“Measure”,结果呈现在Result窗口中[11]。分析结果以均数±标准差的方式表示。

数据采集完成后,用SPSS13.0统计软件分析,两组之间采用两独立样本均数t检验。以α=0.05为检验标准,P < 0.05认为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色

低硒组大鼠肝肾出现明显的纤维化组织,而对照组中极少见纤维化组织。肝脏中,纤维化主要发生在汇管区,纤维化组织分布在大血管周围,环形分布,肝小叶区域少见纤维化组织。肾脏中,纤维化主要发生在肾门区域,表现为肾门区域原有的包绕结缔组织增宽增厚(图 1)。

图 1(Figure 1)
图 1 肝肾HE染色结果

Figure 1 HE staining of liver and kidney of the rats in low-selenium and control groups.

2.2 免疫组化染色CCR7的表达

在肝中,阳性表达位置主要在中央静脉周围,阳性细胞呈环型放射状分布在中央静脉四周,或簇状分布,随着与中央静脉距离变远而减少,阳性细胞主要呈卵圆形、圆形、纺锤形。细胞染色阳性呈棕黄色,以胞浆着色为主,也有一部分细胞核阳性染色。雌性低硒组阳性点数(146 178±97 135)高于对照组(42 210±48 626),P> 0.05。雄性低硒组阳性点数(188 313±168 463)高于对照组(170 289±168 463),P>0.05。

在肾中,阳性表达位置主要在肾小管区域,随肾小管走形分布。肾小球细胞周围阳性染色极少。细胞染色阳性呈棕黄色,着色部位基本在胞浆,细胞核阳性染色少见。近球小管区雌性低硒组阳性像素点数(64 028±33 447)高于对照组(60 691±28 606),P>0.05,近球小管区雄性低硒组阳性像素点数(104 929±30 462)高于对照组(66 183±39 469),P>0.05;远球小管中雌性低硒组阳性像素点数(301 730±140 244)低于对照组(501 644±136 243),P>0.05,远球小管中雄性低硒组阳性像素点数(149 253±53 264)低于对照组(224 123±144 798),P>0.05(图 2、3)。

图 2(Figure 2)
图 2 免疫组化染色结果显示雌性组CCR7在肝肾中的表达

Figure 2 Immunohistochemistry of CCR7 in the liver and kidney of female rats in low-selenium and control groups.

图 3(Figure 3)
图 3 免疫组化染色结果显示雄性组CCR7在肝肾中的表达

Figure 3 Immunohistochemistry of CCR7 in the liver and kidney of male rats in low-selenium and control groups.

2.3 免疫组化染色CD163的表达

在肝中,阳性表达位置基本与上述相同。阳性染色细胞核较CCR7抗原多见。雌性低硒组阳性点数(71 329±54 902)低于对照组(243 238±123 630),P=0.022。雄性低硒组阳性点数(58 665±20 387)低于对照组(330 619±120 638),P=0.001。

在肾中,阳性表达位置主要在肾小管区域,肾小球内少见阳性染色。近球小管区雌性低硒组阳性像素点数(141 047±160 714)低于对照组(213 000±68 968),P>0.05,近球小管区雄性低硒组阳性像素点数(89 971±73 180)低于对照组(230 940±56 416),P < 0.05;远球小管中雌性低硒组阳性像素点数(117 928±29 820)低于对照组(382 455±98 827),P < 0.05,远球小管中雄性低硒组阳性像素点数(56 965±13 134)低于对照组(271 823±135 003),P < 0.05(图 4、5)。

图 4(Figure 4)
图 4 免疫组化染色结果显示雌性组CD163在肝肾中的表达

Figure 4 Immunohistochemistry of CD163 in the liver and kidney of female rats in low-selenium and control groups.

图 5(Figure 5)
图 5 免疫组化染色结果显示雄性组CD163在肝肾中的表达

Figure 5 Immunohistochemistry of CD163 in the liver and kidney of male rats in low-selenium and control groups.

2.4 免疫组化染色CD206的表达

在肝中,阳性表达位置主要在中央静脉周围,细胞间隙染色较深,阳性染色细胞核较少见。雌性低硒组阳性点数(108 577±80 999)高于对照组(69 302±28 846),P>0.05。雄性低硒组阳性点数(91 062±60 986)高于对照组(70 832±46 044),P>0.05。

在肾中,阳性表达位置主要在肾小管区域,与上述相同。近球小管区雌性低硒组阳性像素点数(161 406±62 249)高于对照组(49 245±15 480),P < 0.05,近球小管区雄性低硒组阳性像素点数(72 043±38 247)高于对照组(5714±3104),P < 0.05;远球小管中雌性低硒组阳性像素点数(207 726±52 631)高于对照组(48 948±35 176),P < 0.05,远球小管中雄性低硒组阳性像素点数(15 674±17 910)低于对照组(14 157±6597),P>0.05(图 6、7)。

图 6(Figure 6)
图 6 免疫组化染色结果显示雌性组CD206在肝肾中的表达

Figure 6 Immunohistochemistry of CD206 in the liver and kidney of female rats in low-selenium and control groups.

图 7(Figure 7)
图 7 免疫组化染色结果显示雄性组CD206在肝肾中的表达

Figure 7 Immunohistochemistry of CD206 in the liver and kidney of male rats in low-selenium and control groups.

2.5 免疫组化染色结果的统计学分析

对低硒和正常组肝肾免疫组化3个部位3种标记物的染色强度结果做统计学分析,对比与汇总结果见图 8~10。在肝中,CCR7雌性相较雄性实验组表达明显多于对照组,CD163、CD206雌性雄性对比相当,前者实验组表达少于对照组,后者实验组多于对照组。在肾的近球小管中,CCR7、CD163雌性雄性对比相当,均为实验组表达少于对照组,CD206雄性相较雌性实验组表达明显多于对照组。在肾的远球小管中,CCR7、CD163雌性雄性对比相当,均为实验组表达少于对照组,CD206雌性相较雄性实验组表达明显多于对照组(图 8~10)。

王丽云, 易建华, 徐航超, 吴晓芳, 李丹阳, 韩晶
西安交通大学医学院公共卫生学系, 陕西西安 710061
收稿日期:2016-03-22
基金项目:国家自然科学基金青年基金(81402639);陕西省自然科学基金(2015JQ8310);中央高校基本科研业务费专项资金资助
作者简介:王丽云, 本科。
通信作者:韩晶, 讲师
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