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胰高血糖素样多肽-1对2型糖尿病大鼠学习与记忆能力的治疗

放大字体 缩小字体 发布日期:2016-11-08 17:43 来源:南方医科大学学报 浏览次数:0
关键词: 胰高血糖素样多肽-1 糖尿病 学习与记忆功能障碍 Arc
摘要: 目的 观察糖尿病治疗药物胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对糖尿病大鼠学习与记忆功能障碍的改善作用。 方法 雄性SD大鼠随机分为正常组(Normal),糖尿病模型组组(DM)和GLP-1治疗组(GLP-1)。采用高脂高糖喂养合并链脲佐菌素(STZ)诱导建立2型糖尿病模型。将糖尿病大鼠模型随机分为糖尿病组和GLP-1组,糖尿病组大鼠不进行治疗,GLP-1组大鼠于糖尿病成型后第25天,以经皮下埋缓释泵方式给予GLP-1(30 pmol/kg/min)治疗7 d。治疗结束后先使用Morris水迷宫实验评估各组大鼠的学习及认知能力,然后或获取大鼠大脑海马区组织,用实时定量PCR(Real-time PCR)检测认知相关基因的转录,蛋白印迹法(Western blotting)检测认知相关蛋白的表达,免疫组化检测认知相关蛋白的表达和细胞定位。 结果 Morris水迷宫实验显示糖尿病组大鼠的学习和记忆功能显著下降(P < 0.05),荧光定量PCR结果发现糖尿病大鼠脑内APP,BACE1,Arc,ERK1/2,PKA,PKC的基因转录升高(P < 0.05),Western Blotting和免疫组化结果显示Arc蛋白分子在糖尿病大鼠中表达升高。而GLP-1处理组大鼠的学习和记忆功能比糖尿病组有显著改善(P < 0.05),脑内APP,BACE1,Arc,ERK1/2,PKA,PKC基因转录表达明显减少(P < 0.05),Arc表达降低。 结论 GLP-1治疗能够显著改善2型糖尿病大鼠的学习与记忆功能障碍,其效果可能是通过调控细胞的PKC,PKA,ERK1/2通路,抑制Arc的表达而实现的。

全球糖尿病发病率正处于快速增长期,根据国际糖尿病联盟(IDF)最新的公布的第七版糖尿病数据显示,2015年全球糖尿病患者人数4.15亿,患病率8.8%。全球糖尿病患病率呈快速上升趋势,预计2040年糖尿病患者数将达6.42亿,患病率将上升至10.4%。中国糖尿病患者数2015年达1.096亿,居全球首位,预计到2040年中国糖尿病患者数将达1.507亿[1]。糖尿病常引起严重并发症,除血管病变、视网膜病、肾病和外周神经病变等传统并发症外,近来糖尿病脑病也越来越引起人们的注意[2]。糖尿病脑病在临床表现为认知功能障碍、痴呆、精神性疾患等,并且其发病隐匿,不易察觉[3]。随着糖尿病并研究的逐步深入,已经发现糖尿病与认知障碍之间有明显的相关性,是诱发AD(Alzheimer's Disease)的一个危险因素[4]。在成年糖尿病患者中,常常伴有一定学习和记忆功能障碍,并且阿尔茨海默病发病率的风险显著增高2~3倍[3]。糖尿病患者常伴发抑郁症, 而抑郁症等不良情绪对糖尿病的代谢控制及转归有消极影响,因此控制糖尿病脑病对于糖尿病的治疗有重要的意义。目前用于改善学习与记忆功能的药物主要有他克林、卡巴拉汀、加兰他敏、多奈哌齐、美金刚等,它们主要通过以乙酰胆碱前体、乙酰胆碱酯酶抑制剂和选择性胆碱能受体激动剂的方式,暂时性缓解疾病症状,寻找能有效防治糖尿病脑病的药物具有非常重要的意义[5]。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由肠壁L-细胞分泌的激素,其作用包括刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌,促进胰岛素生物合成,降低血糖,保护胰岛B细胞,改善T2DM的症状[6]。此外,近年发现它还能促进神经细胞的增殖和神经发生,抑制神经细胞凋亡。例如,Gault报道[7]GLP-1不仅直接调节神经递质的释放和LTP(synaptic plasticity)的形成,而且能保护由β-淀粉样蛋白片段诱导的突触LTP损伤。目前认为GLP-1及其类似物的这种作用可能与其能保护脑细胞和增加脑血流量有关[8-9],对于GLP-1对于脑部的保护作用的已经有一定研究[10-12],但有关其保护的分子机理尚不清楚。

本研究通过GLP-1治疗糖尿病模型动物,观察GLP-1改善糖尿病引起的大鼠学习与记忆功能的损伤及其可能的机理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选取6~8周的SD雄性大鼠,体质量160~180 g购买自南方医科大学动物实验中心, 合格证号SCXK(粤)2011-0015。所有动物操作均依照制度动物保健和使用委员会的指导方针。

1.1.2 主要试剂

GLP-1自上海波肽生物公司合成(500 mg,纯度>95%),链脲佐菌素(STZ)购自sigma公司(批号S0130-1G)。抗Arc抗体购自santa cruz公司(sc-15325),抗β-actin抗体购自博世德公司(BM1623),羊抗兔二抗购自弗德生物公司(FDR007),荧光定量PCR试剂盒购自TAKARA公司(RR047A, RR820A),水合氯醛、甲醛购自广州金华大化学试剂有限公司,所有化学试剂均为分析纯度。

1.1.3 仪器

Applied Biosystems 7500荧光定量PCR仪(美国ABI),安准血糖检测仪(长沙三诺生物传感技术有限公司),2001植入式胶囊渗透压缓释泵(美国Alzet公司),酶标仪(美国Biorad),水迷宫仪器购买自上海移数公司,鼠博士行为学软件用于水迷宫数据分析。

1.2 实验方法

1.2.1 分组和给药

雄性SD大鼠27只于实验前适应性喂养1周后,随机分为3组,每组9只。对照组大鼠常规饲料喂养,糖尿病大鼠参照沈亚非[13]等的方法制备糖尿病大鼠模型,采用高脂高糖饲料喂养,1个月后,大鼠腹腔注射链脲佐菌素40 mg/kg,3 d后监测血糖,连续2 d血糖均高于16.7 mmol/L认定为2型糖尿病。糖尿病大鼠喂养25 d后被随机分成模型组和GLP-1组,模型组糖尿病大鼠不做治疗处理。GLP-1组通过皮下手术包埋植入式渗透压泵灌注GLP-1(30 pmal/kg/min),连续给药7 d。

1.2.2 Morris水迷宫

水迷宫实验参照Wang等[14]的方法。试验简述如下:水迷宫在一个直径160 cm的圆形黑色水池中进行,水温保持在25±2 ℃,一个12 cm直径透明圆形平台放置在水下2 cm。定位航行定在每天下午2点进行,连续5 d。实验时,已经提前1 h适应的大鼠被面朝池壁分4个象限放入水中,动物60 s内寻找到平台的时间记录为逃避潜伏期。在60 s内没有找到平台的大鼠,则用小木棍引导至平台,并让平台上停留15 s,让其记忆空间标记物,记录逃避潜伏期为60 s。成功在60 s内到达平台动物同样让其在平台休息15 s。试验结束。每只大鼠每次游泳时候的路线和逃避潜伏期都会被记录下来。

在定位航行实验完成后24 h,进行空间探索实验,我们把平台移除,让大鼠在原来平台对侧象限入水,在水池中游泳60 s,记录大鼠游泳的路线,计算通过原来平台的次数和在原来平台象限的时间百分比。

1.2.3 荧光定量PCR检测基因mRNA转录水平

荧光定量PCR检测基因mRNA转录水平:大鼠迅速断头后,头部沿着中线剪开皮肤,再剪刀向上挑着把颅骨剪开,到嗅区空洞处向左向右各剪1刀,然后用镊子把颅骨扒开,迅速把脑部放到冰冻的PBS中,用镊子分离大脑海马区组织。切碎研磨采集的大鼠海马区组织,提取各组总RNA,测定浓度,各取1 μg总RNA用于RT-QPCR检测,引物序列如表 1所示,检测方法参照试剂盒说明书。

表 1(Table 1)

表 1 大鼠来源引物序列 Table 1 Primer sequences from rats Name Forward primer (5'-3') Reverse primer (5'-3')
Arc CTGAGATGCTGGAGCACGTA GCCTTGATGGACTTCTTCCA
APP GTGATCTACGAGCGCATGAA AGAAGGCATGAGAGCATCGT
BACE1 GCTGCAGTCAAGTCCATCAA ATTGCTGAGGAAGGATGGTG
PKC TCCTTCACAACCAGGGCATC GGACTCCAAAGGACCACCAG
PKA CTTGGCCCCCGAGATTATCC GTTCCGAAGCAGGTCCTTCA
PS1 CAAGAGCTGCTGTCCAGGAA TGAAAATGGCGAGCAGGAGT
ERK1 CACTGGCTTTCTGACCGAGT ATGTGGTTGAGCTGGTCCAG
ERK2 GGTTGTTCCCAAACGCTGAC GTCGTCCAGCTCCATGTCAA
Β-actin CAACACAGTGCTGTCTGGTG GATCCACATCTGCTGGAAG
表 1 大鼠来源引物序列

Table 1 Primer sequences from rats

1.2.4 Western blotting

自采集大鼠的海马组织中提取蛋白质。每100 mg大鼠大脑组织加入1 mL RIPA裂解液,充分研磨裂解,12 000 g离心15 min,将上清转移到干净无菌的离心管中,BCA法测定蛋白的浓度,用裂解液调整蛋白浓度一致,取20 μL调整好蛋白浓度样品,加入5 μL的5×还原性的SDS-PAGE上游缓冲液,混匀,沸水煮样品10 min使其变性。上胶100 V恒压20 min,下胶180 V 50 min的SDS-PAGE(10%胶)电泳后,200 mA恒流90 min转膜,把膜取出后置于5% BSA封闭2 h,之后把膜放置稀释后一抗中,4 ℃孵育过夜。次日,把膜用TBST洗4次后,置于稀释后2抗中(1:5000),摇床中室温孵育1 h。把膜在TBST洗4次后,在膜上加入ECL发光液发光,最后在暗室中曝光显影条带。

1.2.5 免疫组化检测Arc在大鼠海马区表达变化及定位

石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ15 min-二甲苯Ⅱ15 min无水乙醇Ⅰ10 min-无水乙醇Ⅱ10 min-95%酒精5 min-90%酒精5 min~80%酒精5 min-70%酒精5 min-蒸馏水洗。抗原修复:组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8 min,停火8 min,然后中低火7 min,此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。阻断内源性过氧化物酶:切片放入3%过氧化氢溶液,室温避光孵育25 min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。加一抗:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走),在圈内滴加用3% BSA室温封闭30 min,甩掉BSA滴加按一定比例稀释好的一抗覆盖组织。切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜。加二抗:玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加组化试剂盒内与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织,室温孵育50 min。DAB显色:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下控制显色时间,阳性为棕黄色,自来水冲洗切片终止显色。复染细胞核:Harris苏木素复染3 min左右,自来水洗,1%的盐酸酒精分化数秒,自来水冲洗,氨水返蓝,流水冲洗。脱水封片:将切片依次放入70%酒精5 min-80%酒精5 min-90%酒精5 min-95%酒精5 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。

1.2.6 统计分析

应用SPSS 20.0软件进行统计分析。水迷宫实验采用two-way ANOVA,bonferroni法对组别进行检验分析,其他实验采用one-way,bonferroni法对组别进行检验分析,以P < 0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2型糖尿病动物模型成功建立,动物出现显著的糖尿病病症

在采用高糖高脂饲喂大鼠4周后腹腔注射链脲佐菌素,注射链脲佐菌素3 d后,连续空腹血糖检测达到25.8±3.1 mmol/L(表 2),高于糖尿病标准值16.7 mmol/L,连续空腹血糖检测,其中显示血糖一直高于16.7 mmol/L,并且大鼠具有典型的多饮、多食、多尿、尿液混浊、消瘦等糖尿病病,表明2型糖尿病大鼠模型制作成功。

表 2(Table 2)

表 2 注射STZ后大鼠空腹血糖值 Table 2 Fast blood glucose in rats after STZ injection (mmol/L, Mean±SD, n=9) Group Day 1 Day 2 Day 7 Day 14 Day 21 Day 28
DM 25.7±3.3 24.5±2.8 25.6±3.7 25.8±3.7 24.6±2.7 24.1±2.7
Normal 6.4±0.6 6.4±0.6 6.4±0.5 6.3±0.4 6.15±0.5 7.4±0.3
表 2 注射STZ后大鼠空腹血糖值

Table 2 Fast blood glucose in rats after STZ injection (mmol/L, Mean±SD, n=9)

2.2 GLP-1治疗能显著改善糖尿病大鼠的学习与记忆功能

采用高糖高脂STZ诱导方法制备糖尿病动物模型后,我们参照文献报道方法,采用Morris水迷宫实验观察3组大鼠(正常大鼠、糖尿病大鼠、GLP-1处理组大鼠)在水池内游泳并找到藏在水下逃避平台的能力,判断GLP-1的保护作用。

(1) 定位航行实验是用于测量大鼠学习和记忆能力的经典方法。如表 3所示,各组之间的潜伏期在前2 d没有观察到显著区别(P>0.05),但自第3天起,DM组的潜伏期明显比Normal组潜伏期延长(P < 0.05),该趋势持续到第4天和第5天,显示STZ诱导的DM组大鼠的学习记忆功能自第3天后表现出明显受损。而同时接受GLP-1处理的糖尿病大鼠,其第3天的潜伏期显著低于糖尿病组(P < 0.05),与Normal组差异不显著(P>0.05)。这种现象在第4天和第5天都持续观察到,说明GLP-1能减轻糖尿病对大鼠学习功能的破坏,保护大鼠的学习功能(表 3)。大鼠在定位航行实验中的游泳速度,各组游泳速度没有显著差异,说明动物自主运动能力没有差异(表 4)。

表 3(Table 3)

表 3 Morris水迷宫实验定向航行实验检测大鼠逃避潜伏期 Table 3 Escape latency of rats in place navigation in Morris water maze test (s, Mean±SD, n=9) Group Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5
Normal 51.67±4.39 29.03±4.33 14.62±3.83 14.69±3.82 11.36±1.41
DM 48.57±4.51 33.37±6.14 33.41±5.11# 33.33±5.35# 32.17±5.45#
GLP-1 47.08±4.39 30.65±6.73 19.82±2.53* 22.42±4.46* 18.85土3.02*
#P < 0.05 vs Normal group, *P < 0.05 vs DM group.
表 3 Morris水迷宫实验定向航行实验检测大鼠逃避潜伏期

Table 3 Escape latency of rats in place navigation in Morris water maze test (s, Mean±SD, n=9)

表 4(Table 4)

表 4 Morris水迷宫实验定向航行实验大鼠游泳速 Table 4 Velocity of swimming in place navigation in Morris water maze test (cm/s, Mean±SD, n=9) Group Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5
Normal 23.29±5.36 22.25±4.29 17.42±4.06 18.29±4.89 17.54±2.46
DM 21.65±5.24 20.20±5.23 18.967±3.86 20.88±4.38 20.90±3.98
GLP-1 20.487±2.78 21.84±4.47 20.97±2.72 21.42±3.57 19.08±4.33
表 4 Morris水迷宫实验定向航行实验大鼠游泳速

Table 4 Velocity of swimming in place navigation in Morris water maze test (cm/s, Mean±SD, n=9)

(2) 空间探索实验用于测量大鼠在学会寻找平台后,对平台位置记忆的保持能力。定位航行实验结束后24 h,撤去平台,从原平台对面象限中央放入水中,记录其在水池中游泳轨迹,计算60 s内通过原平台的次数,以及在原平台象限的保留时间。在本实验中,与Normal组穿过原平台次数相比,DM组次数显著减少,显示DM组的记忆功能损伤。而GLP-1组通过平台次数高于DM组,统计分析显示有显著性差别(P < 0.05),基本接近Normal组水平(P>0.05),表 5展示了各组大鼠在目标象限的时间百分比数字。统计分析显示DM组与正常对照组之间有显著性差异(P < 0.05),说明糖尿病大鼠有明显的记忆能力障碍,而GLP-1处理组百分比显著好于DM组百分比(P < 0.05),与Normal组接近(P> 0.05),表明GLP-1能减轻糖尿病引起的记忆功能损伤。

表 5(Table 5)

表 5 穿越原平台次数(次)及停留原平台所在象限停留时间百分比 Table 5 Number of crossing the original platform and time percentage in the target quadrant (Mean±SD, n=9) Group Times of crossing platform Time in target quadrant (%)
Normal 4.25±1.25 29.66±7.38
DM 1.25±0.50# 17.79±3.99#
GLP-1 3.50±0.57* 30.13±3.50*
#P < 0.05 vs Normal group, *P < 0.05 vs DM group.
表 5 穿越原平台次数(次)及停留原平台所在象限停留时间百分比

Table 5 Number of crossing the original platform and time percentage in the target quadrant (Mean±SD, n=9)

2.3 GLP-1调节大鼠海马区中多个记忆相关基因mRNA的表达

取各组大鼠的大脑海马区组织,Real-time PCR方法分析记忆相关基因在大鼠大脑海马区mRNA的转录水平,以进一步了解糖尿病大鼠脑损伤和GLP-1保护作用的分子机制。PKC,PKA和ERK1/2是细胞内与细胞增殖、分化和凋亡最密切的常见信号通路;Arc作为PKC,PKA,ERK1/2信号通路下游的分子,能够调控APP,PS1,BACE1等分子的表达和修饰,从而调控Aβ的产生[15]。与正常组相比,糖尿病大鼠大脑细胞内PKC,PKA,ERK1/2的表达均有增高(P < 0.05),同时诱导Arc,APP,PS1,BACE1的表达升高(P < 0.05),这些变化是引起糖尿病大鼠脑学习与记忆功能障碍的主要信号途径(表 6)。而GLP-1处理能够抑制PKC,PKA和ERK1/2,以及其下游的Arc,APP,PS1,BACE1升高(P < 0.05)。表明GLP-1是通过抑制这条通路分子的表达来实现对脑细胞功能的保护。

表 6(Table 6)

表 6 荧光定量PCR检测大鼠海马区中mRNA表达RQ Table 6 Relative mRNA expressions of genes related with cognitive function in the hippocampus of the rats(Mean±SD) Gene Normal DM GLP-1
PKC 1.00±0.25 3.51±0.28# 1.02土0.13*
PKA 1.00±0.25 8.92±0.39# 5.05±1.71*
ERK1 1.00±0.24 4.89±1.79# 2.15土0.13*
ERK2 1.00±0.34 6.18±0.52# 3.05土0.16*
APP 1.00±0.10 5.44±0.96# 0.47土0.05*
Arc 1.00±0.13 13.36±1.25# 2.71土0.47*
BACE1 1.00±0.08 7.60±0.95# 0.63土0.09*
PS1 1.00±0.27 11.09±0.914# 1.63土0.64*
#P < 0.05 vs Normal group, *P < 0.05 vs DM group.
表 6 荧光定量PCR检测大鼠海马区中mRNA表达RQ

Table 6 Relative mRNA expressions of genes related with cognitive function in the hippocampus of the rats(Mean±SD)

2.4 GLP-1抑制糖尿病大鼠海马区Arc的表达

为了在蛋白水平进一步证实ARC的作用,我们从各组大鼠大脑海马区组织提取蛋白,进行Western blotting实验。DM组的Arc表达显著高于Normal组,而GLP-1组ARC表达比DM组要低(图 1)。这些结果同PCR结果相吻合,即ARC在糖尿病大脑细胞中表达增高,GLP-1处理后糖尿病大鼠海马区ARC的表达下降。

图 1(Figure 1)
图 1 WB检测Arc在各组大鼠海马区表达

Figure 1 Detection of Arc expression in the hippocampus of the rats by Western blotting.

2.5 免疫组化检测Arc在大鼠海马区表达变化及定位

Arc为神经突触后蛋白,Arc的变化与AD的发生有密切联系。我们采用免疫组化方法进一步证实ARC的变化和作用。图 2中表明Arc蛋白在大鼠海马区的表达位置及含量。图中蓝色染色为海马区细胞,黄褐色为Arc在细胞中的蛋白表达位置。在正常组细胞中几乎观察不到明显黄褐色的Arc表达,而DM组中细胞膜的上黄褐色明显增多,显示ARC蛋白表达增多。与DM组相比,GLP-1组中细胞膜的黄褐色有所下降。该结果同上述的PCR和蛋白印迹方法相互吻合,表明ARC是影响脑细胞功能的重要分子,GLP-1可能是通过抑制糖尿病诱导的ARC过高表达,达到保护大鼠学习与记忆功能的作用。

谭照光1,2,3, 高维鸿1,2,3, 蔡祥胜1,2,3, 王方4, 惠宏襄1,2,3,5
1. 南方医科大学生物技术学院, 广东广州 510515 ;
2. 南方医科大学国际病代谢中心, 广东广州 510515 ;
3. 东莞南方医大代谢医学研发有限公司, 广东东莞 523000 ;
4. 南方医科大学神经生物教研室, 广东广州 510515 ;
5. 美国加州大学洛杉矶医学院胰腺病中心, 美国加州 90095
收稿日期:2016-03-21
基金项目:国家973基金(2011CB504006);松山湖科技基金(2010B025,2010B026);广东科技基金(2010B090400041);博士点基金(20104433110014)
作者简介:谭照光, 硕士研究生。
通信作者:惠宏襄, 教授
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