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蛋白-8样分子2对热损伤小鼠CD4阳性T细胞凋亡的影响

中国学术期刊网【临床医学论文】 编辑:天问 南方医科大学学报 2016-11-08
蛋白-8样分子2对热损伤小鼠CD4阳性T细胞凋亡的影响论文作者:黄鹤 田昭涛 姚咏明 黎檀实,原文发表在《南方医科大学学报杂志》,经中国学术期刊网小编精心整理,仅供您参考。

关键词: 肿瘤坏死因子α 蛋白-8样分子2 热损伤 脓毒症 免疫 凋亡
摘要: 目的 探讨肿瘤坏死因子-α诱导的蛋白-8样分子2(TIPE2)对重度烫伤小鼠模型脾脏CD4+T淋巴细胞的凋亡的影响。 方法 140只成年雄性BALB/C小鼠分为6组,应用小RNA干扰技术制作siTIPE2/过表达慢病毒,复制小鼠重度烫伤模型。分离BALB/c小鼠脾脏CD4+T细胞,检测各组CD4+T淋巴细胞凋亡,Smad2/Smad3、磷酸(P)-Smad2/P-Smad3以及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)家族蛋白Bcl-2/Bim的表达。检测各组小鼠CD4+T内线粒体膜电位改变情况及细胞色素C的变化和各组小鼠CD4+T内含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-3)、(caspase-8)、(caspase-9)的活化情况。 结果 siTIPE2-burn组CD4+T淋巴细胞凋亡率为12.33%,较sham组外其余组减少,P-smad2/P-Smad3蛋白表达(灰度值)显著降低(P < 0.01)。siTIPE2-burn组Bcl-2的蛋白表达较其余组升高(P < 0.05),Bim的表达则降低(P < 0.05)。siTIPE2-burn组线粒体膜电位细胞色素C水平均较sham组外其余组降低(P < 0.05),caspase-3活性较TIPE2-burn组降低(P < 0.01),caspase-8、caspase-9活性较其余组降低(P < 0.05)。TIPE2-burn组凋亡率最高,TIPE2-burn组Smad2/Smad3蛋白表达较sham组明显升高(P < 0.05),P-smad2/P-Smad3蛋白表达较其余组显著升高(P < 0.05);CD4+T内线粒体膜电位较其余组降低(P < 0.01),细胞色素C水平升高,caspase-3、caspase-8、caspase-9活性较其他组均升高(P < 0.05)。 结论 TIPE2作为一种重要的负向调控分子,可通过促进转化生长因子β即TGF-β/Smads信号传导通路、线粒体相关凋亡途径加速T淋巴细胞凋亡。 

严重烧、创伤及外科大手术应激打击极易诱发脓毒症等感染并发症,进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS),是临床烧、创伤和危重患者最主要死亡原因之一。尽管临床治疗已取得显著进展,但病死率仍居高不下,成为直接影响患者预后、阻碍进一步提升危重烧伤救治成功率的突出难题,因此,提高对脓毒症的认识和防治水平无疑具有重要的理论价值及临床意[1]。

淋巴细胞凋亡在维持免疫稳态和自身免疫耐受中起着重要作用。在严重创伤打击时,无论是在中枢还是外周淋巴器官中均发现了大量淋巴细胞凋亡[2]。淋巴细胞凋亡增加可能是机体免疫抑制发生的重要机制之一[3-4]。Smad2和Smad3是转化生长因子β1(TGFβ1)下游受体激活蛋白,活化的TGFβ1使Smad2/Smad3发生磷酸化而被激活,受到Bcl-2家族的促凋亡和抗凋亡蛋白的调节,通过细胞色素C的释放激活胱天蛋白酶(caspase-9)。最终活化的caspase-8、caspase-9都通过激活下游的caspase-3介导细胞的调亡。Bcl-2、Bcl-xl维护线粒体的完整性从而阻碍了细胞色素C的释放;Bax、Bim等促凋亡成员则促进了这一过程的发生。

肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8样分子2(TIPE2)是新近发现的蛋白,在体内试验中,敲除小鼠TIPE2基因两个月后发现部分动物出现慢性疾病,表现为体重减轻、脾肿大、白细胞增加和多器官自发性炎症反应,说明TIPE2缺乏容易诱发广泛性炎症[5-6]。本课题组先前研究已证实TIPE2在烫伤小鼠T淋巴细胞存在表达,烫伤后24 h表达最高[7-8],并且发现沉默TIPE2后烫伤小鼠中IFN-γ显著升高而IL-4水平显著下降,IFN-γ/IL-4比值明显升高,说明脾脏TIPE2可能参与组织局部促炎和抗炎性细胞因子表达调节,并对局部免疫产生影响。我们假设TIPE2是介导严重烧伤后T淋巴细胞免疫功能障碍的关键调控分子,并很可能通过线粒体相关凋亡途径调节T淋巴细胞凋亡发挥作用。本研究通过研究TIPE2与CD4+ T细胞凋亡之间的关系,探讨其参与严重烧伤后脓毒症的调控机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

实验小鼠为健康清洁级BALB/C小鼠,购自中国医学科学院医学实验动物研究所,均为雄性,体质量20±2 g。140只成年雄性BALB/C小鼠分为6组:烫伤组(burn)40只,假伤组(Sham)40只,沉默TIPE2组(siTIPE2-burn)15只,沉默病毒对照组(siTIPE2-siTIPE2-negative-burn)15只,过表达TIPE2组(TIPE2-burn)15只,过表达病毒对照组(TIPE2-negative -burn)15只。

1.2 RNA干扰及过表达

TIPE2小RNA干扰慢病毒表达载体(siRNA)由上海吉凯公司合成,siRNATIPE2的DNA靶序列为5'-GAAGTGAAACTCAGGTCCG-3'[5],对照组RNA序列5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。过表达DNA靶序列上游引物为GAGGATCCCCGGGTACCGGTC GCCACCATGGAGTCCTTCAGCTCA,下游引物为TCCTTGTAGTCCATACCGAGCTTGCCCTCGTCC AG。过表达对照组采用空载体质粒。合成DNA片段转移至pGCL-GFP构建pFIV-H1/U6-copGFP载体,转染过程严格按照说明书执行。

1.3 动物模型

小鼠适应性饲养1周,自由进食水,室温25 ℃,昼夜节律为12 h。术前禁食12 h,自由饮水。小鼠乙醚麻醉后,剃去背部鼠毛,暴露背部在99 ℃热水中烫8 s,根据公式计算小鼠体表面积,造成15%面积皮肤烫伤模型。假伤组小鼠除了浸泡温水,其他麻醉方式和喂养同烫伤组。后4组通过尾静脉分别注射携带siTIPE2/过表达或空载体对照慢过表达或空载体对照慢病毒,待2周后复制小鼠burn模型,术后予0.9%生理盐水40 mL/kg抗休克治疗,所有小鼠在烫伤24 h处死。动物实验相关方案通过动物伦理委员会批准,动物处置过程所有操作符合动物伦理学标准。

1.4 脾脏CD4+ T细胞分离

小鼠断颈处死后无菌条件下取脾脏,分离小鼠脾脏单个核细胞。采用MiniMACS免疫磁性分离系统,每108个单核细胞加入100 μL生物素-抗体“鸡尾酒”,4 ℃避光预冷10 min。然后加入300 μL PBS,200 μL抗生物素磁珠4 ℃避光预冷15 min后离心洗涤。500 μL PBS重悬细胞,通过LS柱阴性分选后收集留出的细胞悬液,离心洗涤获得CD4+ T细胞,分离出的CD4+ T用FITC标记抗CD4抗体孵育,流式细胞术鉴定正常小鼠脾脏CD4+ T细胞纯度(图 1)。

图 1(Figure 1)
图 1 Western blot检测burn组、TIPE2-burn组和siTIPE2-burn组TIPE2蛋白表达

Figure 1 expressions of TIPE2 in burn, TIPE2-burn and siTIPE2-burn groups

1.5 流式细胞术检测CD4+ T细胞凋亡

根据PE Annexin-V凋亡试剂盒,离心收集细胞(5×105),用预冷的PBS洗2遍(1200 r/min离心8 min);加入100 μL的稀释液1% Binding buffer重悬细胞,分别加入5 μL Annexin V和7AAD混匀,4 ℃避光反应20 min;加入300 μL的稀释液Binding buffer,1 h内流式细胞仪检测。

1.6 蛋白质免疫印迹试验(Western blot)检测

检测各组小鼠CD4+ T淋巴细胞内TIPE2,Smad2/ Smad3、磷酸化(P)-Smad2/P-Smad3以及Bcl-2/Bim的蛋白表达。采用BCA法对小鼠CD4+ T细胞总蛋白进行定量分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中细胞蛋白上样量均为50 μg,取30 μL浓缩物上样,用100 g/L聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。第一抗体为兔抗鼠TIPE2多克隆抗体(1:500),兔抗鼠Smad2单克隆抗体(1: 2000),兔抗鼠(P)-Smad2多克隆抗体(1:500),兔抗鼠Smad3单克隆抗体(1:2000),兔抗鼠(P)-Smad3单克隆抗体(1:2000),兔抗鼠Bcl-2单克隆抗体(1:1000),兔抗鼠Bim多克隆抗体(1:500),第二抗体为辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG(1:2500),单克隆β-actin作为蛋白对照,比较烫伤组和烫伤RNAi-TIPE2组TIPE2蛋白表达情况,观察TIPE2基因沉默效果。应用ImageJ软件分析目标条带的灰度值进行蛋白定量。

1.7 流式细胞仪检测CD4+ T线粒体膜电位变化

按JC-1试剂盒说明书配制染色工作液。将各组细胞重悬于0.5 mL细胞培养液中,并加入0.5 mL的JC-1染色工作液,颠倒数次以混匀。于细胞培养箱中37 ℃孵育20 min,600 r/min 4 ℃离心3~4 min,沉淀细胞。弃上清,用JCM染色缓冲液洗涤2次后行流式细胞仪分析。

1.8 共聚焦荧光法检测CD4+ T细胞色素C表达

收集5×105各组小鼠CD4+ T细胞,PBS润洗3次,1500 r/min离心5 min,弃上清,收集细胞。加入4%多聚甲醛溶液500 μL室温下固定30 min,PBS洗涤去上清,加入500 μL 0.2%的TritonX-100室温下穿孔20 min。PBS润洗细胞2次,1200 r/min离心5 min,弃上清。加入500 μL阻断缓冲液(1% BSA),室温下封闭30 min。按1:400比例用1% BSA稀释细胞色素C抗体500 μL,4 ℃反应过夜。PBS洗涤1遍,1:200比例稀二抗500 μL避光孵育1 h,PBS润洗细胞2次,弃上清。加入200 μL的DAPI染色30 min。载玻片滴20 μL样本,加1滴DAPI混匀,加盖玻片,激光扫描共聚焦显微镜观察。

1.9 化学比色法检测各组CD4+ T内caspase活性

取收集1×106各组小鼠CD4+ T细胞,PBS洗涤2次,弃上清,加入250 μL预冷的Lysis buffer混匀,冰浴10 min将样品细胞裂解,1000 g离心5 min,收上清转移至EP管中。检测取96孔培养板中进行,反应体系包括:100 μg蛋白(体积50 μL)、50 μL现配的反应液、5 μL的caspase比色底物,37 ℃避光孵育2 h,Spectra MR全功能酶标仪上检测405 nm处的吸光度值。实验设调零孔组2个,一组为不加蛋白样本组,另一组为不加比色底物组,剩余体积均由稀释液补足。各实验组设2个空白孔。

1.10 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件,数据采用均数±标准差表示,组间样本比较采用方差分析,两两比较采用方差齐性检验,若方差齐性则使用LSD检验,方差不齐采用Dennett t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠脾脏CD4+ T细胞纯度

从脾脏分离CD4+ T细胞,通过流式细胞仪检测提取的正常小鼠脾脏CD4+ T细胞的纯度达到92.9%。胎盘蓝染色活细胞率达到98%。

2.2 CD4+ T细胞内TIPE2蛋白表达(图 2)

图 2(Figure 2)
图 2 CD4+ T内Smad2和P-Smad2蛋白表达

Figure 2 expressions of Smad2/P-smad2 in CD4+ T cells

Western blot检测结果显示,TIPE2基因沉默使小鼠脾脏CD4+ T淋巴细胞TIPE2表达下调>70%;TIPE2-burn组TIPE2蛋白表达使小鼠脾脏CD4+ T淋巴细胞TIPE2表达上调>50%。

2.3 各组CD4+ T细胞凋亡率比较

CD4+ T调亡率TIPE2-burn组凋亡率最高(69.8%),而siTIPE2-burn组CD4+ T调亡率为12.33%,与Sham组(10.82%)无统计学差异,但显著低于其余5组(P < 0.01)。

2.4 CD4+ T内Smad2/Smad3、P-Smad2/P-Smad3和Bcl-2/Bim蛋白表达

从图 2、3表 1、2可以看出,burn组Smad2/Smad3和P-smad2/P-Smad3较sham组和siTIPE2-burn组升高;siTIPE2-burn组Smad2/Smad3无明显降低,P-smad2/ P-Smad3表达较其余组显著降低(P < 0.05)。TIPE2-burn组Smad2/Smad3较sham组明显升高(P < 0.05),较其余组无统计学意义,P-smad2/P-Smad3表达较其余组显著升高(P < 0.05)。再结合图 4、表 3可见,siTIPE2-burn组Bcl-2的表达升高(P < 0.05),Bim的表达则降低(P < 0.05)。TIPE2-burn组反之。

图 3(Figure 3)
图 3 Western blot检测CD4+ T内Smad3和P-Smad3蛋白表达

Figure 3 expressions of Smad3/P-Smad3 in CD4+ T cells

图 4(Figure 4)
图 4 各组小鼠脾脏CD4+ T内Bcl-2/Bim蛋白表达

Figure 4 expressions of Bcl-2/Bim in CD4+ T cells

表 1(Table 1)

表 1 各组小鼠脾脏CD4+T内Smad2/P-Smad2蛋白表达比较 Table 1 expressions of Smad2/P-Smad2 in CD4+T lymphocytes (Mean±SD) Group Smad2 P-smad2
Sham 1.05±0.20 1.95±0.30
Burn 1.52±0.38* 2.13±0.12*
siTIPE2-burn 1.48±0.40 1.77±0.25#
siTIPE2-negative-burn 1.53±0.26 2.15±0.46
TIPE2-burn 1.60±0.15# 2.98±0.52Δ
TIPE2-negative-burn 1.55±0.51 2.16±0.42
Smad2: *P < 0.05 burn group vs sham and siTIPE2-burn groups. #P < 0.05, TIPE2-burn group vs sham group. P-smad2: *P < 0.05 burn group vs sham and siTIPE2-burn groups; #P < 0.05, siTIPE2-burn group vs burn and TIPE2-burn groups; ΔP < 0.05, TIPE2-burn vs other groups.
表 1 各组小鼠脾脏CD4+T内Smad2/P-Smad2蛋白表达比较

Table 1 expressions of Smad2/P-Smad2 in CD4+T lymphocytes (Mean±SD)

表 2(Table 2)

表 2 各组小鼠脾脏CD4+T内Smad3/P-Smad3蛋白表达比较 Table 2 expressions of Smad3/P-Smad3 in CD4+ T lymphocytes (Mean±SD) Group Smad3 P-smad3
Sham 0.85±0.34 0.95±0.10
Burn 0.92±0.33* 1.10±0.05*
siTIPE2-burn 0.78±0.42 0.76±0.15#
siTIPE2-negative-burn 0.93±0.56 1.08±0.16
TIPE2-burn 0.98±0.05a 1.48±0.08Δ
TIPE2-negative-burn 0.97±0.41 1.09±0.11
Smad3: *P < 0.05 burn vs siTIPE2-burn group; #P < 0.05, TIPE2-burn vs sham group. P-smad3: *P < 0.05 burn vs sham and siTIPE2-burn groups; #P < 0.05 siTIPE2-burn vs burn and TIPE2-burn groups; ΔP < 0.05, TIPE2-burn vs other groups.
表 2 各组小鼠脾脏CD4+T内Smad3/P-Smad3蛋白表达比较

Table 2 expressions of Smad3/P-Smad3 in CD4+ T lymphocytes (Mean±SD)

表 3(Table 3)

表 3 各组小鼠脾脏CD4+T内Bcl-2/Bim蛋白表达比较 Table 3 expressions of Bcl-2/Bim in CD4+ T lymphocytes (Mean±SD) Group Bcl-2 Bim
Sham 1.15±0.20 1.06±0.30
Burn 1.22±0.38 1.11±0.12
siTIPE2-burn 1.58±0.40* 0.87±0.25*
siTIPE2-negative-burn 1.23±0.26 1.15±0.46
TIPE2-burn 0.90±0.15# 1.48±0.52#
TIPE2-negative-burn 1.25±0.51 1.16±0.42
*P < 0.05 siTIPE2-burn vs other groups; #P < 0.05, TIPE2-burn vs other groups.
表 3 各组小鼠脾脏CD4+T内Bcl-2/Bim蛋白表达比较

Table 3 expressions of Bcl-2/Bim in CD4+ T lymphocytes (Mean±SD)

2.5 CD4+ T线粒体膜电位变化

siTIPE2-burn组线粒体膜电位为(97.50±2.40)%,较sham组(98.20±1.20)%外其余组比较升高(P < 0.05)。TIPE2-burn组CD4+ T内线粒体膜电位为(70.90±1.4)5%,较其余组降低(P < 0.01)。

2.6 CD4+ T细胞色素C表达(图 5)

图 5(Figure 5)
图 5 各组CD4+ T细胞色素C表达

Figure 5 Changes in cytochrome C in CD4+ T cells. The cytochrome C protein was directly labeled as red by the red pigment, and the DAPI was stained with blue. A: Sham; B: Burn; C: siTIPE2-burn; D: siTIPE2-negative-burn; E: TIPE2-burn; F: TIPE2-negative -burn.

siTIPE2-burn组细胞色素C水平为33.50±3.40%,较除sham组(23.20±3.40)%外降低,(P < 0.05);TIPE2-burn组细胞色素C水平为(51.90±3.41)%,较其余组有所升高(P < 0.05)。

2.7 化学比色法检测各组CD4+ T内caspase活性

siTIPE2-burn组CD4+ T内caspase-3较sham组,burn组,siTIPE2-negative-burn组和TIPE2-negativeburn略降低,但无统计学意义;较TIPE2-burn组降低(P < 0.01),caspase-8、caspase-9活性较其余组降低(P < 0.05)。TIPE2-burn组caspase-3、caspase-8、caspase-9活性较其他组均升高(P < 0.05,表 4)。
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