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乌司他丁对肺血管平滑肌细胞表型转化的影响

放大字体 缩小字体 发布日期:2016-11-08 17:21 来源:南方医科大学学报 浏览次数:0
关键词: 乌司他丁 低氧 平滑肌细胞 表型转换 细胞增殖 细胞运动
摘要: 目的 探讨乌司他丁对低氧诱导的肺血管平滑肌细胞(PASMCs)表型转化的影响及其分子机制。 方法 体外培养SD大鼠PASMCs,随机分组4组:正常组(N组),常氧+乌司他丁组(NU组),低氧组(H组),低氧+乌司他丁组(HU组),各组培养24 h后采用免疫荧光检测SM-α-actin和Calponin表达水平,应用CCK-8法、3H-TdR和Transwell小室检测各组PASMCs增殖和迁移。并分别利用Western blotting和荧光素酶报告质粒检测PPAR-γ蛋白表达和转录活性。采用PPAR-γ抑制剂GW9662进行预处理干预乌司他丁对低氧诱导的PASMCs表型转化的影响,分析干预后PASMCs增殖和迁移改变。 结果 低氧条件下,乌司他丁能促进PASMCs中SM-α-actin和Calponin的表达(P < 0.05),抑制PASMCs的增殖和迁移能力(P < 0.05),同时乌司他丁上调PPAR-γ的表达(P < 0.05)。采用GW9662预处理后,乌司他丁对低氧诱导的PASMCs表型转换的抑制作用显著下降(P < 0.05)。 结论 乌司他丁通过上调PPAR-γ抑制低氧诱导的PASMCs表型转换。

低氧性肺血管重塑(HPVR)在低氧性肺动脉高压(HPH)发生发展中起重要作用,而其中HPVR是多种疾病的主要病理特征,主要包括慢性阻塞性肺疾病、慢性=肺源性心脏病等[1]。此病理过程中,肺血管平滑肌细胞(PASMCs)的表型转换是HPVR的基本病理变化。表型转换是指在各种病理因素,如低氧刺激,PASMCs从高分化的收缩型转换为未分化的合成型,并获得增殖、迁移和合成、分泌大量细胞外基质的能力,促进血管的病理改变[2]。抑制PASMCs表型转换已经成为多种心血管疾病的防治靶点。乌司他丁是一种蛋白酶抑制剂,可抑制胰蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种水解酶的活性,从而稳定溶酶体膜和细胞膜、抑制白细胞过度激活、减少氧自由基和促炎因子的释放,可有效地抑制炎性反应[3]。但其药物作用对低氧诱导的PASMCs表型转换的作用尚不明确。最新研究发现,过氧化物酶增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)有显著的肺血管保护作用[4-5],提示其在PASMCs表型转换中可能具有一定作用。乌司他丁对PASMCs表型转换的影响及其机制是否与PASMCs中PPAR-γ的异常表达有关,尚需讨论。本研究拟评价乌司他丁对低氧诱导的PASMCs表型转换的影响及其作用机制,为临床工作提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 实验材料和试剂

PASMCs为本实验室保存;低糖DMEM培养基、胎牛血清购直美国gibco公司;胰蛋白酶、二甲基亚砜购自北京索莱宝科技有限公司;SM-α-actin,Caplonin,PPARγ, β-actin购自英国Abcam公司;PPARγ荧光素酶报告质粒(p-PPARγ-Luc)由汉恒生物科技公司合成;乌司他丁由本科室提供;GW9662购自美国Sigma公司。Cell counting Kit-8(CCK-8)检测试剂盒、3H-TdR检测试剂盒购自日本的Dojindo公司;Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 细胞处理及分组

PASMC采用DMEM完全培养基(10% FBS)进行传代培养。实验分组如下:N组,常氧下培养24 h(氧浓度21%);NU组,常氧条件下,用乌司他丁(8000 U/mL)处理培养24 h;NUG组,常氧条件下,用乌司他丁(8000 U/mL)和GW9662(20 μmoL)(PPAR-γ抑制剂)混合液处理培养24 h;H组,低氧培养24 h(氧浓度1%);HU组,低氧条件下,用乌司他丁(8000 U/mL)处理培养24 h。HUG组,低氧条件下,用乌司他丁(8000 U/mL)和GW9662(20 μmoL)混合液处理培养24 h。

1.3 细胞免疫荧光

各组培养24 h后PBS清洗,依次加入4%多聚甲醛固定30 min,0.1% Trition-100 20 min,5% BSA于37 ℃封闭1 h,用SM-α-actin一抗(1:100),Caplonin一抗(1: 100)混合孵育,4 ℃过夜,次日取出湿盒,置于室温复温1 h,PBS洗去一抗,再用Cy3荧光二抗(1:500)和Alexa Flour448荧光二抗(1:500)混合液37 ℃孵育1.5 h,PBS洗去二抗,DAPI复染5 min,抗荧光淬试剂封片,在激光共聚焦显微镜下观察结果。

1.4 细胞迁移检测

采用Transwell小室检测PASMCs迁移能力。在Transwell小室上室和下室之间孔径为8 μm的聚碳酸酯微孔膜上铺上Matrigel溶液50 μL,37 ℃聚合30 min,上室加入100 µL无血清的培养基,小室为600 µL含10%胎牛血清的培养基,N组和H组上室加入100 µL无血清的培养基,NU组和HU组上室加入含8000 U/mL乌司他丁100 µL无血清的培养基, NUG组和HUG组上室加入含8000 U/mL乌司他丁和20 μmol GW9662的100 µL无血清的培养基将培养瓶中的细胞进行洗涤、消化,重悬,收集细胞后分别加入上室,每室100 μL,每组设3个复孔,之后置与常氧或低氧条件下培养24 h,24 h时去除培养基并用PBS清洗3次,室温下甲醛固定15 min。去除固定液后加入0.5%结晶紫染液,室温作用10 min。用棉签擦去基质胶和上室内的细胞。拍照并计数穿过滤膜的细胞,随机选取5个视野,取平均值。

1.5 细胞增殖检测

采用CCK-8法检测PASMCs增殖情况,分别于各组培养结束前1 h时随机取4孔加入CCK-8试剂孵育1 h后,使用酶标仪检测450 nm光密度值,读取数据并记录。同时采用3H-TdR检测PASMCs增殖情况,相应时间点结束培养6 h前于每孔内加入1μCi 3H-TdR,消化并收集细胞,用预冷的10%三氯乙酸沉淀DNA,再用0.5 mL 1 mol/L NaOH提取;然后用0.5 mL 1 mol/L HCl中和NaOH,用孔径为0.2 μm滤器或玻璃纤维滤纸滤出DNA提取物,烘干;用液闪计数器测定每分钟放射性脉冲数,读取数据并记录。

1.6 Western blotting检测

各组细胞培养24 h后,收集各组总蛋白,之后采用BCA法测定各组的蛋白浓度,100 ℃将蛋白煮沸变性。取总蛋白40 µg进行凝胶电泳,随后将蛋白电转印至PVDF膜(恒流300 mA,转膜时间90 min),于常温下侵入5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h,分别加入1:1000小鼠抗大鼠PPAR-γ单克隆抗体,1:4000小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体,置于4 ℃恒温摇床上孵育过夜,TBST洗膜10 min×3次后,加1:5000稀释的羊抗小鼠二抗,室温孵育2 h,TBST洗膜5 min×3次,加入DAB显色液显色,采用Imager凝胶成像分析系统进行灰度扫描, 并进行条带的蛋白含量分析。

1.7 荧光素酶报告质粒检测PPARγ转录活性

取对数生长期PASMCs接种于细胞培养瓶,细胞贴壁后用Lippfectamine转染PPAR-γ报告质粒(P-PPAR-γ-Luc)3 µg,4 h换液。12 h后将细胞消化重新种于24孔板,待细胞贴壁后,用乌司他丁进行处理细胞。24 h后,裂解细胞,收集裂解液,并按照试剂盒操作说明进行荧光素酶活性测定。每组实验重复3次,结果取平均值。

1.8 统计学方法

统计学处理采用SPSS 13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用成组t检验和单因素方差,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乌司他丁对低氧诱导的PASMCs表型转换标准蛋白的影响

免疫荧光分析显示(图 1),PASMCs在低氧情况培养24 h后,与对照组相比,SM-α-actin和Caplonin荧光强度明显下降,提示其表达量显著降低(P < 0.05),出现表型转换。在使用乌司他丁干预后,PASMCs在常氧培养24 h后的表型转换标志蛋白没有明显变化(P > 0.05),而PASMCs在低氧培养24 h后的表型转换标志蛋白有所升高(P < 0.05)。

图 1(Figure 1)
图 1 乌司他丁对低氧PASMCs表型转换标志蛋白的影响

Figure 1 Effect of ulinastatin on phenotype modulation marker of PASMCs under hypoxic condition (Original magnification: × 200). N: Normoxic group; NU: Normoxic+ulinastatin group; H: Hypoxic group; HU: Hypoxic+ulinastatin group.

2.2 乌司他丁对低氧诱导的PASMCs增殖和迁移的影响

CCK-8、3H-TdR分析显示,与对照组相比,PASMCs在低氧培养24 h后增殖能力显著增高(P < 0.05)。乌司他丁处理后,PASMCs在常氧培养24 h后增殖能力无明显变化(P > 0.05),而在低氧情况下培养24 h后增殖能力明显下降(P < 0.05)。Transwell迁移结果显示,与对照组相比,PASMCs在低氧培养24 h后迁移能力明显增强(P < 0.05)。在使用乌司他丁干预后,PASMCs在常氧培养24 h后的迁移细胞数没有明显变化(P > 0.05),而PASMCs在低氧培养24 h后的迁移细胞数明显减少(P < 0.05,图 2)。

图 2(Figure 2)
图 2 乌司他丁对低氧PASMCs增殖和迁移的影响

Figure 2 Effect of ulinastatin on proliferation and migration of PASMCs under exposed to hypoxia (C: × 200). A: 3H-TdR assay; B: CCK-8 assay; C: Transwell assay. *P < 0.05 vs N group, #P < 0.05 vs H group.

2.3 乌司他丁对低氧PASMCs中PPAR-γ表达的影响

Western blotting结果显示,与对照组相比,PASMCs在低氧培养24 h后PPAR-γ的蛋白表达水平明显下降(P < 0.05)。而在乌司他丁预处理后,PPAR-γ的蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)。荧光素酶报告质粒分析显示,与对照组相比,PASMCs在低氧条件培养24 h后PPAR-γ的转录活性明显受到抑制(P < 0.05)。而在乌司他丁预处理后,PASMCs在低氧培养24 h后PPAR-γ的转录活性有所增加(P < 0.05,图 3)。

图 3(Figure 3)
图 3 乌司他丁对低氧PASMCs中PPARγ表达的影响

Figure 3 Effect of ulinastatin on PPARγ expression in PASMCs exposed to hypoxia. A: Western blotting; B: Luciferase report assay. *P < 0.05 vs N group; #P < 0.05 vs H group.

2.4 GW9662预处理对乌司他丁抑制低氧诱导的

PASMCs表型转换的影响CCK-8、3H-TdR分析显示,GW9662预处理后,乌司他丁抑制低氧PASMCs增殖的作用降低(P < 0.05)。Transwell迁移结果显示,与对照组相比,GW9662预处理后,乌司他丁抑制低氧PASMCs迁移能力的作用降低(P < 0.05,图 4)。

唐锟, 刘畅, 陈林, 高静, 张超
第三军医大学西南医院麻醉科, 重庆 400038
收稿日期:2016-04-12
基金项目:国家自然科学基金(81170053)
作者简介:唐锟, 主治医师。
通信作者:张超, 主治医师
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