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PCNA基因在小鼠睾丸发育全过程中的表达规律

放大字体 缩小字体 发布日期:2016-11-04 11:58 来源:云南大学学报(自然科学版) 浏览次数:0
关键词: 睾丸发育; 小鼠; PCNA基因; 免疫组化; 原位杂交
摘要:为探讨 PCNA基因在小鼠睾丸生后发育全过程中的表达规律,以16组出生后不同发育时期的昆明种正常小鼠睾丸组织为材料,在其石蜡组织切片上进行PCNA蛋白的免疫组化检测及 PCNA基因的DNA-mRNA原位杂交检测.结果发现:PCNA蛋白仅在精原细胞及初级精母细胞中表达,其表达峰值出现在小鼠生后第11天; PCNA基因在初级精母细胞、次级精母细胞、圆形精子细胞以及少数精原细胞中均有表达,其中初级精母细胞中的表达信号相对强烈.上述结果表明, PCNA基因参与了小鼠睾丸发育过程中精原细胞及初级精母细胞的DNA复制过程,其mRNA表达和蛋白质表达存在着一定差异.

中图分类号:Q954.43 文献标志码:A 文章编号:0258-7971(2016)05-0820-07 doi: 10.7540/j.ynu.20160214

精子发生是指从精原细胞发育成为外形成熟精子的全过程, 在这一复杂过程中, 生精细胞的频频分裂增殖及其不断的发育分化是其核心事件之一.增殖细胞核抗原(proliferation cell nucleus antigen, PCNA)是细胞增殖过程中一个必不可少的基因, 为DNA复制起始所必需[1].同时, PCNA也是一个重要的细胞周期调控蛋白, 在不同的调控通路中作为多种蛋白的功能转换因子发挥作用, 参与了细胞周期时相的转换、染色体重组、DNA甲基化及细胞凋亡等过程[2, 3].关于 PCNA 基因在小鼠精子发生过程中的探讨, 现有研究多集中于如有毒化学物质、重金属、热应激或疾病等因素诱导下PCNA 蛋白病理性表达的探讨[4, 5, 6, 7].而PCNA基因在正常睾丸发育过程中的表达, 现有研究大多局限于睾丸发育过程中的部分阶段[8, 9].系统性、能涵盖小鼠生后睾丸发育全过程、且同时从蛋白质及mRNA水平进行探讨的实验研究尚不多见.因此, 本研究拟从蛋白质及mRNA水平来系统探讨不同发育阶段昆明种正常小鼠睾丸组织中 PCNA基因的表达时间及细胞定位, 以较为完整地揭示PCNA基因在小鼠生后睾丸发育全过程中的时空表达规律, 探讨其与功能活动的关系, 从而为男性生育的临床研究提供动物学实验依据.

1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 小鼠睾丸 实验选用的不同发育阶段昆明种健康雄鼠均由昆明医科大学实验动物中心提供.小鼠根据生后日龄的不同分为以下16组:1、4、8、11、15、20、23、27、30、33、36、40、43、47、50日龄及54日龄.每组随机挑选5只健康雄鼠.

1.1.2 检测试剂盒 PCNA鼠抗人单克隆抗体及相关免疫组化检测试剂购于福州迈新生物技术开发有限公司; PCNA原位杂交探针及系列检测试剂购于天津灏洋生物制品公司.

1.2 实验方法
1.2.1 石蜡组织切片制备 颈椎脱臼法处死小鼠, 迅速取其两侧睾丸, 置于10%中性甲醛中固定过夜, 乙醇系列梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋.分别将原位杂交切片(厚6μ m)和免疫组化切片(厚3μ m)贴于多聚赖氨酸防脱载玻片上, 62℃ 烤片1h后室温贮存备用.

1.2.2 H.E染色 H.E染色按常规H.E染色技术[10]进行操作.

1.2.3 PCNA蛋白免疫组化实验 每组取5张切片(5只小鼠中, 每只随机抽取1张切片), 二甲苯脱蜡、系列梯度乙醇水化后, 柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复法修复抗原.3% H2O2室温孵育10min; 0.01mol/L PBS冲洗3次, 每次3min.非免疫山羊血清50μ L 滴加于组织切片上室温孵育20min; 滴加经PBS适当比例稀释的PCNA抗体室温孵育60min(阴性对照组以PBS代替一抗工作液).之后以PBS冲洗, 再滴加即用型MaxVisonTM试剂, 室温孵育20min.PBS冲洗后滴加适量DAB显色剂(现用现配), 光学显微镜下观察至细胞核阳性颜色与细胞外背景颜色对比反差明显时及时终止反应.苏木素复染, 不同梯度乙醇逐步脱水、二甲苯透明、中性树胶封片.Nikon-90i显微镜拍照.

1.2.4 PCNA基因探针制备 PCNA探针采用地高辛标记的寡核苷酸探针, 合成序列为:5'-GTAGG AGACA GTGGA GTGGC TTTTG TGA-3'.

1.2.5 PCNA基因原位杂交实验 每组取5张切片(5只小鼠中, 每只随机抽取1张切片), 二甲苯脱蜡, 系列梯度乙醇复水, 0.01mol/L PBS 冲洗后滴加打孔液, 室温10min.PBS 冲洗, H2O2室温20min; PBS洗, 复合消化工作液滴加于切片上, 室温20min; PBS洗后0.2× SSC室温3min; 预杂交工作液滴加于切片上, 37℃ 湿盒孵育1h; 0.2× SSC室温洗3次, 每次5min; 滴加适量的杂交工作液后盖上原位杂交专用盖玻片, 37℃湿盒孵育过夜.揭去盖玻片, 2× SSC 37℃洗3次, 每次 5min; 0.2× SSC 37℃洗3次 , 每次 5min; 切片上滴加抗地高辛生物素标记的抗体工作液, 37℃湿盒孵育45min; PBS冲洗, 高敏过氧化物酶链亲和素复合物工作液滴加于切片上, 37℃湿盒孵育45min; PBS冲洗, DAB显色, 至细胞质阳性颜色与细胞外背景颜色对比度反差明显时及时终止反应, 苏木素复染.不同梯度乙醇逐步脱水、二甲苯透明、中性树胶封片.Nikon-90i显微镜拍照.

1.2.6 PCNA阳性细胞百分率统计 16组原位杂交切片和16组免疫组化切片每组均分别计数3张切片, 每张切片均随机选择10个PCNA原位杂交/免疫组化检测出现阳性结果的曲细精管, 在显微镜下计数:①总生精细胞数、PCNA原位杂交检测阳性的生精细胞数; ②总生精细胞数、PCNA免疫组化检测阳性的生精细胞数.分别计算出原位杂交或免疫组化检测中阳性生精细胞所占的百分率.实验结果均用 x± s表示.

2 结 果
2.1 PCNA蛋白免疫组化实验结果
未出现阳性反应的细胞核呈现蓝色, 出现阳性反应的细胞核呈现蓝黑色.

2.1.1 1日龄及4日龄睾丸 小鼠睾丸组织曲细精管任何一层细胞中均未检测到PCNA蛋白的免疫阳性信号.而在睾丸曲细精管的管腔中检测到免疫阳性信号, 且1日龄睾丸中的信号较4日龄睾丸强烈(图1A和B).


图1
Fig.1
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图1 不同发育时期昆明种小鼠睾丸组织PCNA蛋白表达结果(× 200)
Fig.1 The results of PCNA protein expression in the testes of Kunming Mice at different development stages(× 200)

2.1.2 8日龄睾丸 曲细精管内各层细胞的胞核中均出现PCNA蛋白的免疫阳性信号, 这些细胞在曲细精管中呈无规律分布.结合H.E染色结果判断, 这些细胞为精原细胞(图1C).

2.1.3 11日龄睾丸 曲细精管中离开基底膜第2层及其以内细胞的胞核出现免疫阳性信号, 结合H.E染色结果判断, 这些细胞为精原细胞(图1D).

2.1.4 15日龄睾丸 曲细精管中的免疫阳性信号较11日龄睾丸强烈, 具有强免疫阳性反应的细胞为离开基底膜第2层及其以内的细胞, 结合H.E染色结果判断, 这些细胞分别为精原细胞和初级精母细胞(图1E).

2.1.5 20日龄睾丸 曲细精管中具有PCNA蛋白强免疫阳性反应的细胞多集中于离开基底膜1~4层的细胞, 结合H.E染色结果判断, 这些细胞为部分精原细胞和初级精母细胞(图1F).

2.1.6 23、27、30、33、36、40、43、47、50日龄及54日龄睾丸 这10个时期睾丸组织曲细精管内具有免疫阳性反应的细胞均为离开基底膜第1~2层的细胞, 结合H.E染色结果判断, 这些细胞为部分精原细胞及部分初级精母细胞(图1G~P).

2.2 PCNA基因原位杂交结果
出现阳性反应的细胞质呈现棕黄色.

2.2.1 1、4、8、11日龄睾丸 这4个时期小鼠睾丸组织曲细精管任何一层细胞中均未检测到PCNA基因的阳性杂交信号(见图2A~D).


图2
Fig.2
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图2 不同发育时期昆明种小鼠睾丸PCNA基因表达结果(× 200)
Fig.2 The results of PCNA gene expression in the testes of Kunming Mice at different development stages(× 200)

2.2.2 15、20日龄睾丸 曲细精管中离开基底膜第2 层或第3 层直至以内细胞的胞质区出现PCNA基因的阳性杂交信号, 少数离开基底膜第1层的细胞也出现阳性杂交信号.结合H.E染色结果进行判断, 上述细胞为初级精母细胞及少数精原细胞(图2E和F).

2.2.3 23日龄睾丸 阳性杂交信号主要出现在曲细精管中离开基底膜第2 层或第3 层直至以内细胞的胞质区, 离开基底膜第1层的少数细胞也出现阳性杂交信号.结合H.E染色结果进行判断, 上述细胞为初级精母细胞、次级精母细胞以及少数精原细胞.其中初级精母细胞中杂交信号较强, 而次级精母细胞中信号明显减弱(图2G).

2.2.4 27、30、33、36、40日龄睾丸 这5个时期睾丸组织中, 阳性杂交信号均主要出现在曲细精管中离开基底膜第2 层或第3 层直至以内细胞的胞质区, 离开基底膜第1层的少数细胞也出现阳性杂交信号.结合H.E染色结果进行判断, 上述细胞分别为初级精母细胞、次级精母细胞、圆形精子细胞及少数精原细胞.其中初级精母细胞中杂交信号较强, 而次级精母细胞及圆形精子细胞中信号明显减弱(图2H~L).

2.2.5 43日龄睾丸 阳性杂交信号在有的曲细精管中出现在离开基底膜第1~3层的初级精母细胞、次级精母细胞和少数精原细胞的胞质中, 而在有的曲细精管则出现在离开基底膜第3~6层的次级精母细胞和圆形精子细胞的胞质中(图2M).

2.2.6 47日龄睾丸 阳性杂交信号出现在曲细精管中离开基底膜第1~3层的初级精母细胞、次级精母细胞及少数精原细胞的胞质中(图2N).

2.2.7 50、54日龄睾丸 这2个时期睾丸组织中, 阳性杂交信号均出现在初级精母细胞、次级精母细胞、圆形精子细胞以及少数精原细胞中.其中初级精母细胞中信号较强, 而次级精母细胞及圆形精子细胞中信号明显减弱(图2O~P).

2.3 PCNA原位杂交/免疫组化阳性生精细胞百分率统计结果
小鼠睾丸组织PCNA蛋白免疫组化检测后, 阳性生精细胞百分率统计结果显示:阳性细胞百分率在生后1日和4日为0; 生后8日(35.29%± 2.54%)大幅上升; 于11日(63.53%± 2.32%)达到峰值; 至生后15日(48.75%± 1.59%)时有所下降, 但20日(53.73%± 2.17%)时又小幅上升; 此后历经23日(37.58%± 2.44%)和27日(26.34%± 1.98%)的快速下降后, 在30日(26.88%± 2.06%)、33日(32.54%± 3.63%)、36日(23.42%± 1.09%)、40日(22.75%± 1.62%)、43日(22.61%± 2.49%)这5个时期保持相对平稳状态; 至47日(35.52%± 2.84%)时又出现1个小高峰, 之后于50日(20.68%± 3.02%)及54日(21.20%± 2.79%)时重新下降(图3).


图3
Fig.3
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图3 小鼠睾丸组织PCNA阳性细胞百分率的日龄变化
Fig.3 The age change with percentage ofPCNA positive germs cells in mice testes

小鼠睾丸PCNA基因原位杂交检测后阳性生精细胞的百分率统计结果显示:阳性细胞百分率在生后1日、4日和11日为0; 生后15日(26.32%± 2.88%)大幅上升至峰值; 此后于20日(24.24%± 2.54%)开始缓慢回落, 并在23日(19.64%± 1.79%)、27日(18.54%± 2.08%)、30日(23.29%± 1.32%)、33日(23.56%± 2.57%)、36日(22.47%± 2.99%)、40日(20.73%± 1.65%)这6个时期保持相对平稳的水平.至43日(33.14%± 2.37%)时突然又大幅上升, 出现1个更高的峰值, 之后于47日(27.14%± 2.42%)、50日(23.25%± 3.77%)及54日(14.05%± 2.80%)时重新下降(图3).

3 讨 论
PCNA是一个进化上高度保守的蛋白质, 相对分子质量为36ku.其主要功能是作为DNA聚合酶δ 的辅助蛋白, 和复制因子C一起识别引物— 模板复合物, 从而帮助聚合酶δ 进行定位、促进其DNA延伸活性、并保证其在复制过程中不会从DNA链上脱落, 从而直接参与细胞增殖的DNA复制过程[11].其次, PCNA也是一种存在于细胞核中的细胞周期调控蛋白, 与细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白相互作用, 调控细胞周期各个时相的转换[12].由于PCNA只出现在增殖状态的细胞中, 并且在细胞增殖的S期表达量达到峰值, 因此被作为评价细胞增殖状态的一个重要指标[13].

本研究免疫组化结果显示:小鼠睾丸发育过程中, PCNA蛋白的免疫阳性信号出现在精原细胞和初级精母细胞中, 而在其它类型的生精细胞中未检测到表达信号.其原因可能是由于精原细胞及初级精母细胞才有DNA的复制.精原细胞分化成为初级精母细胞之前会经历数次有丝分裂过程, DNA复制处于活跃阶段; 而初级精母细胞第1次减数分裂前的S期中也存在着DNA的复制, 且S期各染色体的DNA复制尚不完全, 还有许多小片段要到减数第1次分裂前期的偶线期才完成复制.因此, PCNA蛋白在精原细胞和初级精母细胞中的表达与其作为DNA复制必需因子这一功能是相一致的.这也从另一个角度提示在初级精母细胞第1次减数分裂的偶线期DNA合成过程中, PCNA基因可能也发挥着作用.

罗兰, 吴艳瑞, 张闻, 陈元晓 昆明医科大学 基础医学院 细胞生物学与医学遗传学系,云南 昆明 650500通信作者:陈元晓(1964-), 男,湖南人,硕士,教授,主要从事细胞生物学研究
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作者简介:罗 兰(1973-),女,湖南人,硕士,教授,主要从事发育生物学方面研究.

收稿日期: 2916-04-25
基金: 云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项资金面上项目(2013FB112)
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