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七氟烷预处理对大鼠肺缺血再灌注损伤细胞自噬的影响

中国学术期刊网【医学论文】 编辑:天问 第三军医大学学报 2016-11-07
七氟烷预处理对大鼠肺缺血再灌注损伤细胞自噬的影响论文作者:邓红 高静 廖林 刘金碧 鲁开智 郑洪 易斌,原文发表在《第三军医大学学报杂志》,经中国学术期刊网小编精心整理,仅供您参考。

[关键词] 七氟烷 肺缺血再灌注损伤 自噬 PI3K信号通路
[摘要] 目的 探讨七氟烷预处理对大鼠肺缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)肺组织中细胞自噬的影响。 方 法 健康成年雄性SD 大鼠75只,采用开胸夹闭左肺门建立IRI模型,将75只大鼠编号后按随机数字表法分为5组:假手术组(Sham),缺血再灌注组(I/R),七氟烷预处理组(SEVO),LY294002组(LY)及七氟烷预处理+LY294002组(PI3K抑制剂)(SEVO+ LY),各15只。缺血1 h,再灌注120 min后处死各组大鼠,取出肺组织,检测大鼠肺组织湿/干重比(W/D),Western blot法测定肺组织Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62及p-PI3K表达。 结果 与Sham组比较,I/R组肺组织发生严重水肿(P<0.05),且肺组织细胞自噬水平增加,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达上调(P<0.05);与I/R组比较,SEVO组肺水肿明显减轻(P<0.05),Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达下调,而p-PI3K表达增加(P<0.05),LY组与I/R组比较差异没有统计学意义(P>0.05);与SEVO组比较,SEVO+LY组中肺水肿明显加重,Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达上调而p-PI3K表达下调(P<0.05)。 结论 七氟烷预处理通过激活PI3K信号转导通路,恢复LIRI期间细胞自噬流,减少自噬性细胞死亡从而对肺缺血再灌注损伤起保护作用。

目前,针对减轻器官缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)的预防措施主要有两大类:手术和药物治疗,手术治疗主要是通过缺血预处理,但由于伦理及技术的限制,在临床操作中未得到广泛推广;药物治疗指各类器官保护药物[1]。七氟烷(sevoflurane,SEVO),一种高效吸入麻醉药,具有可控性强,对呼吸道刺激、血流动力学及交感神经活动影响小等优点,临床应用广。目前,越来越多的研究表明,SEVO可以对脑[2]、心肌[3]、肝脏[4]、肾脏[5]、肠道[6]等器官缺血再灌注损伤产生保护作用。文献[7]报道称其对LIRI也具有保护作用,但相关研究甚少。本实验中,我们探讨SEVO是否对LIRI具有肺保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组与处理

SPF级健康成年雄性SD大鼠由第三军医大学实验动物中心提供,实验动物许可证号:SCXK渝2012-0005,体质量220~250 g。将75只大鼠编号后按随机数字表法分为5组,假手术组(Sham),缺血再灌注组(I/R),七氟烷预处理组(SEVO),LY294002组(LY)及七氟烷预处理+LY294002组(PI3K抑制剂)(SEVO+LY),各15只。

参照Ng等[8]的方法进行大鼠肺IRI建模。对于Sham组大鼠仅开胸游离肺门,不做夹闭处理;I/R组大鼠以无创血管夹夹闭左肺门,1 h后开放血管,关胸;SEVO组大鼠于夹毕肺门前30 min吸入 2.1%七氟烷[9];LY组大鼠夹毕肺门前30 min腹腔给予LY294002 0.3 mg/kg(PI3K抑制剂)[10];SEVO+LY组大鼠夹毕肺门前30 min吸入 2.1%七氟烷(批号:H20130816,Maruishi Pharmaceutical公司,日本),且腹腔给予LY294002 0.3 mg/kg[10]。于再灌注120 min后分别开胸取肺保存。

1.2 大鼠肺组织湿/干质量比(W/D)的测定

取各组大鼠左上肺组织,生理盐水洗净血迹,滤纸搽干表面水迹,以电子天平称取即湿质量(wet),再置入80 ℃烤箱中,24 h后称取即干质量(dry),二者之比即W/D。

1.3 Western blot法检测大鼠肺组织Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62和p-PI3K的表达

抽提各组大鼠左肺组织蛋白并用BCA 法测其浓度。按照Western blot法[11],分别取40 μg蛋白进行上样,电泳,转膜,BSA血清封闭2 h,分别加入一抗(Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62和 p-PI3K,稀释度1∶1 000)于4 ℃冰箱孵育过夜,取出PVDF膜,TBST漂洗3次,二抗(1∶5 000)孵育2 h,化学发光法显色。用Image J软件测其灰度值,以目的蛋白灰度值与内参β-actin 灰度值的比值反映 Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62和p-PI3K的表达情况

1.4 统计学处理

采用统计软件SPSS 13.0进行分析。所有数据均以x±s表示。多组间比较采用双因素方差分析。

2 结果

2.1 大鼠肺组织湿/干质量比值(W/D)

与Sham组比较,I/R组的 W/D值增加(P<0.05);与I/R组比较,SEVO组W/D值显著降低(P<0.05),而LY组与I/R组之间没有明显差异(P>0.05);SEVO+LY组W/D值高于SEVO组(P<0.05,图 1)。


a:P<0.05,与Sham组比较;b:P<0.05,与I/R组比较;c:P<0.05,与SEVO组比较
图 1 各组大鼠肺组织湿重/干重比值(n=15,x±s)
图选项


2.2 Western blot法检测大鼠肺组织自噬水平表达

I/R组大鼠肺组织Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62表达明显高于Sham组(P<0.05);与I/R组比较,SEVO组Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62表达显著降低(P<0.05),LY组与I/R组之间差异没有统计学意义(P>0.05);SEVO+LY组Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62表达高于SEVO组(P<0.05,图 2,表 1)。


图 2 Western blot检测各组大鼠肺组织Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62 的表达情况
图选项


表 1 各组大鼠肺组织Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62 的表达情况 (x±s,n=15)

组别 Beclin-1 LC3Ⅱ/Ⅰ P62
Sham组 0.42±0.01 0.32±0.02 0.11±0.01
I/R组 0.63±0.06a 0.81±0.08a 0.33±0.08a
SEVO组 0.37±0.03ab 0.42±0.04ab 0.24±0.03ab
LY组 0.66±0.11ac 0.73±0.08ac 0.53±0.08ac
SEVO+LY组 0.71±0.11ac 0.83±0.08ac 0.55±0.07ac
a:P<0.05,与Sham组比较;b:P<0.05,与I/R组比较;c:P<0.05,与SEVO组比较
表选项

2.3 Western blot检测大鼠肺组织p-PI3K表达

与Sham组比较,I/R组大鼠肺组织p-PI3K表达下调(P<0.05);与I/R组比较,SEVO组p-PI3K表达显著增加(P<0.05);LY组与I/R组比较,p-PI3K表达差异没有统计学意义(P>0.05);与SEVO组比较,SEVO+LY组p-PI3K表达明显降低(P<0.05,图 3)。


A:Western blot检测结果;B:半定量分析 a:P<0.05,与Sham组比较;b:P<0.05,与I/R组比较;c:P<0.05,与SEVO组比较
图 3 Western blot检测各组大鼠肺组织p-PI3K 的表达情况
图选项


3 讨论

肺缺血再灌注损伤(lung ischemia reperfusion injury,LIRI)多发生于失血性休克、心肺复苏、体外循环、肺移植、一侧病变肺切除后,其中肺移植时,LIRI 发生率可高达25%[12]。肺组织缺血后的再灌注不仅不能恢复肺功能,反而加重肺结构破坏,最终可发展为急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。LIRI发生时,肺毛细血管内皮细胞受损,肺泡毛细血管屏障功能障碍,炎症细胞和炎性介质大量渗出,引起肺泡及间质发生水肿,组织细胞死亡。其中IRI引起细胞死亡的分子机制尚未阐明,目前较为统一的观点是细胞死亡分为坏死和凋亡两个过程,是否自噬性死亡参与其中有待证明。吸入麻醉药具有保护缺血再灌注损伤(IRI)组织器官的作用,已成为共识。Payne等[13]研究发现,细胞分裂活化蛋白激酶(MAPK)信号通路参与了吸入麻醉药的脑保护作用。Rancan[14]已证明,七氟烷对急性肺损伤的保护作用与抑制氧化应激反应和减少炎症介质释放有关。
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