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microRNA-126对血管内皮细胞生长发育的影响

中国学术期刊网【医学论文】 编辑:天问 第三军医大学学报 2016-11-07
microRNA-126对血管内皮细胞生长发育的影响论文作者:任梦宇 迟路湘 欧书林,原文发表在《第三军医大学学报杂志》,经中国学术期刊网小编精心整理,仅供您参考。

[关键词] miR-126 内皮细胞 血管生成
[摘要] 目的 研究microRNA-126(miR-126)对血管内皮细胞生长发育的影响,探寻miR-126可能参与的血管生成过程。 方 法 常规培养脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)。构建miR-126过表达载体并转染HUVECs;实验分为:正常细胞组,空载慢病毒转染组,miR-126过表达慢病毒转染组(n=6);于转染第6天后用qRT-PCR检测内皮生长负性调节因子spred1、Pik3R2的mRNA表达水平,Western blot检测spred1、Pik3R2的蛋白表达水平。 结果 转染第6天后,对qRT-PCR及Western blot检测结果进行分析,过表达组中spread1、Pik3R2的2(-ΔΔCt)值较其余两组低;过表达组中spred1/GAPDH和Pik3R2/GAPDH值也均小于其余两组,差异具有统计学意义(P<0.05)。spred1、Pik3R2的mRNA表达水平明显下调,其蛋白表达水平也明显降低。 结论 miR-126能促进VEGF的内皮细胞增殖及血管生成作用。

内皮细胞是动、静脉和毛细血管的主要组成部分,它们所构成的血管腔起着运送血液及营养的作用,并与组织进行物质交换以维持器官的正常发育和代谢机能。另外,在一些具有调节内皮活性的物质及相关调节因子如VEGF、FGF等的调节作用下,内皮细胞能够很好地维系其自身的功能代谢及血管形成[1-2]。现已知VEGF可作用于血管细胞膜上的相应受体,通过一系列信号转导使内皮细胞分裂、增殖、迁移。VEGF还可以通过ERK及AKT通路传递信号来完成血管生成作用,而spred1和Pik3R2是该通路的负性调节因子,起着抑制血管生成的作用[3-4]。

在不同物种中已经相继发现大量microRNA(miRNA/微小核糖核酸分子)[5]。它通过阻碍蛋白质翻译(转录抑制)或降解信使核糖核酸(mRNA)即基因沉默来调节相关表达。Lewis等[6]估测人类最少有30%的基因是受miRNA调控的。其中,miR-126是迄今检测出仅有的一种能在HUVEC特定表达的miRNA,并成为缺血相关管腔形成的主要潜在靶点及必要调节位点。有报道称,miRNA相关基因缺失的小鼠,其血管发生、发展及其心脏的发育均有严重缺陷[7-8]。此外,通过斑马鱼(zebra fish)模型的研究,得出的结论进一步证实miR-126能调节血管的发展[9-10]。这些结果表明了miRNA在心血管体系的发生和维护方面有着非常重要甚至不可替代的地位。

目前关于miRNA的研究主要集中在肿瘤的生长发育方面,而有关其在心血管系统的形成机制研究得还比较少。既然miR-126在动物模型中的作用如此明显,那么在人的血管内皮细胞中是否也具有类似的调控作用,从而促进损伤内皮的修复和血管的新生以减少和延缓冠脉综合征的发生、发展。我们就此问题,设计了相关实验,从而探讨其中的各种联系和可能的结果。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂

人脐静脉内皮细胞(购于中科院上海细胞库)。胎牛血清和DMEM培养基购自Gibco公司。BamHⅠ、EcoRⅠ均购自日本TaKaRa公司。T4 DNA ligase buffer 购自美国NEB公司。穿梭质粒LV3(表达绿色荧光蛋白,GFP)及其余3种包装质粒PG-p1-VSVG、PG-P2-REV、PG-P3-RRE均为重庆Western Biotechnology 公司提供。一抗:spred1、Pik3R2及内参一抗均购自Abcam公司;二抗:羊抗兔IgG、羊抗小鼠购自Sigma公司。PVDF膜购自Dupont公司;显影液、定影液购自上海冠龙照相器材公司。胶回收试剂盒购自Qiagen公司;质粒小量抽提试剂盒购自Promega公司。荧光定量PCR试剂、Sybr greenⅠ及所用引物均由重庆Western Biotechnology公司根据设计合成。

1.2 实验方法

1.2.1 HUVECs的扩增培养

从-80 ℃液氮罐中取出冻存管迅速放入37 ℃温水中,轻微晃动1 min。拿出冻存管,75%酒精消毒管口,用吸管吸出已溶解的细胞悬液,加入离心管,再加入含10%胎牛血清(FBS)的细胞培养液5 mL,离心5 min。弃上清,加入1 mL 培养液制成细胞悬液。用含20%FBS的细胞培养液适当稀释后接种于培养瓶,37 ℃、5%CO2培养箱中培养,24 h后更换溶液,随后每3天换液1次,继续培养。培养瓶贴壁面至70%~80%融合时,吸弃旧培养基,用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗2次,加入0.25%胰蛋白酶消化液约2 mL 到50 mL 培养瓶中,按上述比例进行消化,收集细胞液入离心管中离心5 min,弃上清,加培养液10 mL,轻轻吹打均匀,按1∶2传代,第4代细胞用于实验。


1.2.2 miR-126过表达慢病毒载体构建

设计合适的引物序列。将DNA oligo退火处理与线性化的LV3质粒在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应,转化感受态细胞。阳性克隆鉴定,重组质粒测序并大量抽提。四质粒系统共转染293T细胞。72 h后收集已转染的细胞上清液并过滤。CsCL密度梯度离心法纯化病毒,收集病毒悬液,逐孔稀释法测定病毒滴度。


1.2.3 HUVECs感染

实验分3组,过表达感染组、空载感染组和正常细胞组。miR-126过表达慢病毒转染组:感染LV3-miR-126组,即含miR-126病毒和GFP;空载慢病毒转染组:感染病毒不含目的基因,即只含GFP。第1天,在24孔培养板接种若干孔,每个孔内接种3×104个HUVECs(靶细胞),铺板时细胞融合约50%。第2天,观察细胞生长状态,病毒感染时的细胞融合度要达到约70%,如细胞状态较好则开始实验。将冻存在-80 ℃的病毒先在冰浴融化后取出,离心20 s使病毒完全悬于离心管底部;通过感染预实验得到理想的MOI(multiplicity of infection)值,按照MOI值准确计算后,再将慢病毒稀释到培养基中。从培养箱中取出细胞,用移液器吸取准确体积的病毒液,加到准备好的培养基内,吸除原有培养基,在感染组靶细胞和空载组对照细胞中分别加入准确体积的病毒液,混匀后放于二氧化碳培养箱37 ℃、5%CO2 孵育过夜。第3天在24 h后将含有慢病毒的培养液替换成正常培养液;观察细胞状态,第1次换液后,确定慢病毒对细胞没有明显毒作用,则可用正常培养液换液。第6天,用倒置荧光显微镜观察,估测慢病毒感染靶细胞的效率。


1.2.4 qRT-PCR

将实验样本分为3个组进行对比:①正常细胞组:未感染组,其他培养条件同感染组;②空载慢病毒转染组;③miR-126过表达慢病毒转染组。引物设计:spred1,正义链为5′-GCGACTCAGGGACAAAATGG-3′,反义链为5′-CAAAAGCCCTAGCATCAGCAG-3′,149 bp;Pik3R2,正义链为5′-GCACGCAGGCAGAGGAGA-3′,反义链为5′-GACGCAGTGCTTGGTGTCG-3′,122 bp;内参β-actin,正义链为5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′,反义链为5′-TGACG-TGGACATCCGCAAAG-3′,205 bp。提取转染6 d后细胞总RNA,反转录为cDNA用于PCR扩增,最终在72 ℃ 检测荧光信号,测出spred1、Pik3R2的mRNA表达水平。


1.2.5 Western blot检测

将每组再分为两个样本进行检测。正常细胞组:样本1、4;空载慢病毒转染组:样本2、5;miR-126过表达慢病毒转染组:样本3、6。按照SDS-PAGE电泳、转膜及抗体杂交后,ECL显影、定影。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件,根据3组间2(-ΔΔCt)值采用单因素方差分析进行比较;Excel软件通过2(-ΔΔCt)值制作spred1、Pik3R2的mRNA相对定量分析柱状图;通过Labworks4.6软件分析Western blot检测出的目的条带灰度值并通过spred1/GAPDH和Pik3R2/GAPDH值生成3组间每个样本蛋白表达量柱状图。

2 结果

2.1 HUVECs的培养

用传代第4代的HUVECs作为实验目的细胞进行慢病毒的感染(图 1)。


图 1 第4代HUVECs形态学鉴定结果 (LM ×100)
图选项


2.2 miR-126过表达慢病毒载体构建

结果分析:测得miR-126基因序列病毒滴度T=1×108 TU/mL(图 2)。


图 2 LV3-miR-126慢病毒载体构建重组质粒测序基因序列
图选项


2.3 miR-126慢病毒感染

空载对照组不含目的基因,感染的细胞数目很低,效率也很低;过表达组含目的基因,感染的细胞数目较多,效率也较高(图 3)。


图 3 miR-126慢病毒感染细胞形态学观察 (×100)
图选项


2.4 qRT-PCR结果

通过2(-ΔΔCt)值进行相对定量分析(图 4),3组样本中miR-126过表达组相对于其他2组,spred1、Pik3R2表达水平明显下降(与空载慢病毒组和正常细胞组对比,P<0.05)。通过扩增、熔解曲线(图 5)我们可以判断各个样品扩增效果较好,说明各样品的反转录并无问题。曲线纵坐标对应的横坐标(Tm)也基本一致,呈现单一熔解峰,此为理想的熔解曲线,表明特异性扩增,不含二聚体及其他杂质。充分反映过表达的miR-126明显降低spred1、Pik3R2的mRNA表达量。
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